沉默雌激素受体β对人脐静脉内皮细胞的影响

发布时间：2020-05-09 01:09

【摘要】：研究目的:雌激素受体α和雌激素受体β(ERα和ERβ)在基因、蛋白质结构上具有一定的差异,为其功能差异提供了理论基础。为更好的区分ERα与ERβ的功能特异性,本研究主要利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特异性的沉默ERβ的表达,探讨ERβ基因沉默对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞周期的影响。研究方法:根据RNAi的设计原则,构建pGFP-U6-Neo-shRNA/ERβ真核表达载体,将该载体转染至HUVEC细胞系。通过RT-qPCR、Western blotting检测ERβ基因mRNA及蛋白质水平表达水平的变化。流式细胞仪检测ERβ沉默后的HUVEC细胞周期。研究结果:重组质粒DNA经酶切和测序鉴定,结果均证实pGFP-U6-Neo-shRNA/ERβ 真 核 表 达 载体 构 建 成 功。将pGFP-U6-Neo-shRNA/ERβ 和 pGFP-U6-Neo-shRNA/NC 空载体分别转染HUVEC,经RT-qPCR、Western blotting进行鉴定,成功构建ERβ表达沉默的质粒。细胞周期结果显示:ERβ基因表达沉默组与转空白载体组相比较,ERβ基因表达沉默组细胞群体中,处于G1期细胞比例降低,而S期细胞比例增高,但差异不具有显著性意义(P0.05)。研究结论:①针对人ERβ分别构建了 3种shRNA载体,质粒经酶切鉴定分析证实目的序列己插入到预计位点,符合设计要求,测序鉴定表明重组质粒中含有针对ERβ基因的目的序列,表明重组质粒构建成功。②瞬间转染至HUVEC,瞬转的结果表明:shRNAl载体对HUVEC在蛋白水平及mRNA抑制水平上最佳,其次为shRNA3,差异具有显著性意义(P0.05)。③用pGFP-U6-Neo-shRNAl、pGFP-U6-Neo-shRNA2、pGFP-U6-Neo-shRNA/NC转染HUVEC48h,用流式细胞仪测细胞周期。结果表明:ERβ基因表达沉默组,处于G0/G1期细胞比例降低,而S期细胞比例增高,但差异不具有显著性意义(P0.05)。
【图文】：

图２－４邋ＮＣ序歹丨Ｊ逡逑

图２－６酶切图逡逑３．３构建的表达载体ｐＧＰＵ６邋／邋ＧＦＰ邋／邋Ｎｅｏ－ｓｈＲＮＡ－ＥＲｐ质粒测序鉴定结果逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54

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本文编号：2655340