ATP-敏感性钾通道开放剂尼可地尔改善高同型半胱氨酸血症的冠心病患者冠脉微循环的机制研究

发布时间：2020-05-14 19:04

【摘要】：随着人民生活水平的提高、生活节奏加快,缺血性心脏病已成为我国居民心血管病死亡率上升的主要原因,也是我国重大慢性非传染性的公共卫生问题。经皮冠脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)是治疗冠心病急性心肌梗死的主要措施,可直接作用于梗塞部位、使病变冠脉再通,从而改善心肌供血。然而,随着对缺血性心脏病发病机制认识的不断深入,中外学者发现:除了传统的慢性阻塞性冠状动脉疾病(Coronary artery disease,CAD),冠脉微血管功能障碍也是造成心肌缺血的重要原因,心外膜大血管的开通≠心肌水平的再灌注。在部分患者中,即使开通梗死相关动脉(Infarct related Artery,IRA),受损心肌仍未得到有效的血流灌注,这种微循环障碍的现象称之为无复流(no reflow,NR)。事实上,每年我国PCI术后无复流的发生率在5%-25%之间。一旦发生无复流,常伴有广泛而严重的心肌损害,患者可出现左室扩张、心功能下降和恶性心律失常,最终增加猝死、充血性心力衰竭等心血管不良事件发生的风险。可见,早期发现及诊断PCI术后的微循环障碍是必要的。大量的流行病学及临床研究发现了很多可导致冠状动脉粥样硬化的危险因素。但是,传统的危险因素只能部分解释冠心病的发生,研究发现有些冠心病患者并不具有传统的危险因素,而与血浆同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平的升高密切相关。高Hcy水平与冠心病的病死率呈正相关,Hcy每增加5umol/L,冠心病死亡率可增加1.52倍。为何伴高同型半胱氨酸血症的冠心病患者无论是血管病变程度(多支血管病变)、还是血管狭窄程度、甚至支架内再狭窄,以及心肌梗死后的死亡率均高于正常同型半胱氨酸水平患者。其中的机制尚无深入研究。是否因为Hcy加重了冠脉微循环障碍,而造成预后不良,这尚未见报道。尼可地尔为作用于三磷酸腺苷敏感型钾离子通道开放剂(ATP-sensitive potassium channel,KATP),既可通过开放血管平滑肌上的ATP敏感钾离子通道开放剂,通道有效扩张微小冠脉,增加缺血区的血氧供应;又能开放心肌线粒体膜上的KATP通道模拟缺血预适应,减少缺血对心肌的损伤。因此,在临床上常用来治疗心绞痛患者。荟萃分析也证实:围PCI期应用尼可地尔可显著减少慢/无复流现象,降低心梗后心衰发生率,改善心功能以及长期预后。因此,尼可地尔是否能够逆转伴有高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia,HHcy)的冠心病患者的愈后,改善冠脉微循环功能障碍,取得冠心病治疗特别是伴HHcy冠心病这一类患者治疗的突破,是我们进一步探讨的问题。本研究的目的在于:1)利用HHcy+心肌梗死模型探讨Hcy是否通过损伤内皮细胞,导致冠脉微循环障碍,心肌细胞缺乏充足血供,而加重冠心病的不良预后;2)在此基础上研究尼可地儿是否可逆转伴随HHcy冠心病的微循环障碍;3)探索尼可地尔对于NO生成和抑制炎症反应等是否参与到HHcy致冠脉微循环障碍的机制当中,从而寻找靶向治疗方法,改善HHcy所致的冠心病严重病变及不良预后。第一部分高同型半胱氨酸加重心梗后小鼠的冠脉微循环损害目的:研究高同型半胱氨酸对小鼠心梗后的冠脉微循环损害。方法:1.将7周C57BL/6的雄性小鼠经过适应性喂养1周后,随机分为三组,分别为对照组:普通全价饲料喂养及饮用双蒸水;高同型半胱氨酸组:含(1.8g/L)同型半胱氨酸双蒸水喂养及普通饲料;叶酸组:高氨酸组+叶酸组,叶酸混悬液,用量为0.071ug/g/day,灌胃,喂养时间为8周;2.分别采用无创鼠尾动脉血压仪检测小鼠的收缩压/舒张压;Hcy试剂盒检测血浆Hcy水平;3.结扎小鼠左冠状动脉前降支,建立急性心肌梗死模型。使用四唑红(Tetramethylethylenediamine,TTC)染色法、心电图明确心梗模型建立。4.通过SPSS19.0分析小鼠的生存曲线对比两组之间的关系。5.小动物超声检测心梗后小鼠心脏功能;6.4周后将所有小鼠处死,通过免疫荧光染色,在显微镜下观察缺血心肌组织的血管生成情况。7.番茄凝集素染色评估心梗后微循环数量变化。结果:1.小鼠喂养Hcy 8周后血浆中Hcy浓度明显高于正常饮食组(P0.05),而叶酸组Hcy水平显著降低。同时HHcy组的收缩压、舒张压较正常组有升高趋势,但无统计学差异。2.建立心梗小鼠模型,结扎前降支血管,肉眼可见心肌组织有红色变为苍白,心电图可见动态ST改变,TTC染色可见灰白色心梗区域,证明小鼠心梗模型建立成功。3.将小鼠分为:假手术组(正常饮食组)、心梗组(正常饮食+心梗组)、HHcy组(HHcy心梗组)、叶酸组(HHcy心梗+叶酸组)。各组小鼠术后28天死亡率对比,与正常组相比,心梗组小鼠的生存率明显下降(P0.01),而HHcy组低于正常饮食组(P0.05),叶酸组小鼠生存率有所提高。4.HHcy对心梗后小鼠心功能影响,左心室射血分数(Left ventricular ejectionfractions,LVEF)、左心室短轴缩短率(Left ventricular Fraction Shortening,LVFS)在HHcy心梗组均低于非HHcy心梗组(P0.05),同时HHcy心梗组左心室舒张末期内径(Left ventricular end-diastolic diameter,LVIDd)、左心室收缩末期内径(Left ventricular end-systolic dimension,LVIDs)高于非Hcy心梗组小鼠(P0.05)。而叶酸补充治疗,Hcy水平降低组,LVEF、LVFS升高,LVIDd、LVIDs下降。5.心梗组心肌CD31的表达强度较假手术组明显下降,HHcy心梗小鼠的CD31表达下降更明显(P0.05),叶酸组治疗后心肌CD31的表达可以提高(P0.05)。6.心梗组番茄凝集素荧光的强度较正常组明显减弱,HHcy组小鼠的下降程度较心梗组下降程度更大(P0.05),叶酸组小鼠的荧光强度有增强(P0.05)。结论:1.伴HHcy可影响心梗后小鼠的血管再生功能以及微循环功能,从而影响心功能,加重心梗后小鼠死亡率的发生。2.叶酸补充,可降低Hcy,部分逆转上述改变,保护心梗后小鼠的微循环障碍以及血管再生功能,对改善小鼠心功能、生存率有促进作用。第二部分尼可地尔改善HHcy小鼠心梗后微循环障碍目的:建立在体小鼠心肌梗死模型,评估尼可地尔预处理能否改善伴HHcy心梗后小鼠的微循环功能障碍。方法:1.小鼠随机分为7组:1)假手术组(Sham组):正常饲养无其他处理;2)常规饮食+心梗组(myocardial infarction,MI组):正常饲养喂养+小鼠心梗组;3)HHcy+MI组:HHcy饮食喂养+小鼠心梗组;4)尼可地尔1组(HHcy+MI组+低剂量尼可地尔组,尾静脉注射尼可地尔5mg/kg);5)尼可地尔2组(HHcy+MI组+中等剂量尼可地尔组,尾静脉注射尼可地尔15mg/kg);6)尼可地尔3组(HHcy+MI组+高剂量尼可地尔组,尾静脉注射尼可地尔45mg/kg);7)Vehicle组(HHcy+MI+PBS对照组,经尾静脉注射等量PBS)。2.预处理尼可地尔对心梗后小鼠生存率、心脏彩超的指标变化;3.苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色心梗后小血管的出血情况以心肌组织变化,苏木素-碱性品红苦味酸(Hematoxylin baisic fuchsi picric acid dyeing,HBFP)各组心肌缺血组织的变化,4.通过CD31免疫荧光染色,在显微镜下观察缺血心肌组织的血管生成情况。5.番茄凝集素评估心梗后小鼠的微循环功能结果:1.随着尼可地尔治疗的浓度升高,HHcy+MI组小鼠的存活率得到改善。2.HHcy心梗后小鼠心功能下降,LVEF、LVFS组明显下降,且LVIDd、LVIDs比正常组扩大,而尼可地尔的预处理可以使得心梗后小鼠的LVEF、LVFS值升高,同时较LVIDd、LVIDs HHcy心梗组缩小(P0.05)。3.HE染色结果可见:正常心肌组织染色心肌横纹清晰,细胞膜完整,未见炎细胞浸润;而心梗组小鼠心肌组织可见红细胞渗出及炎细胞浸润;HHcy心梗组小鼠除了见到炎性细胞浸润,还可见大量纤维化组织增生;尼可地尔预处理各组小鼠的心肌组织病理变化都有明显好转,肌纤维及间质水肿减轻,炎性细胞浸润减少。4.缺血心肌HBFP染色结果,HHcy+MI组缺血面积较MI组增大(P0.05),而尼可地尔可减轻HHcy+MI组缺血面积,但在Nic2组、Nic3组与HHcy+MI组才有统计学差异(P0.05)。5.番茄凝集素实验结果现实,与MI组对比,HHcy+MI组小鼠微循环损伤更严重(P0.05),尼可地尔2、3组可以改善心梗后小鼠微循环功能,心梗后荧光强度较HHcy+MI组明显升高(P0.05)。6.对心肌缺血小鼠血管内皮细胞CD31染色,显微镜下观察心肌组织的荧光强度,发现HHcy+MI组的荧光明显较其它各组减弱,而尼可地尔2、3组,荧光强度升高,血管再生能力增强(P0.05)。结论:1.尼可地尔能够改善HHcy心梗小鼠后的心功能、28天生存率。2.尼可地尔预处理能够有效改善心梗后小鼠的心肌组织的血管损伤,缩小心肌缺血的面积。3.尼可地尔提高心梗后心肌的血管生成能力,同时改善微循环功能。第三部分尼可地尔对HHcy小鼠心梗后微循环障碍的保护机制研究目的:本研究利用HHcy心梗小鼠在体模型,以及利用冠状动脉内皮细胞建立HHcy/缺血缺氧损伤体外模型,探讨尼可地尔HHcy小鼠心梗后微循环障碍的机制,观察PI3K/Akt信号转导通路是否参与其中,明确尼可地尔调节NO和抑制炎症反应,发挥保护微循环损伤的作用机制。方法:在体试验-动物部分1.小鼠随机分为5组:1)假手术组(Sham组):正常饲养无其他处理;2)HHcy+MI组:HHcy饮食喂养+小鼠心梗组;3)尼可地尔组(HHcy+MI组+中等剂量尼可地尔组,尾静脉注射尼可地尔15mg/kg,最适合浓度);4)LY294002组(在结扎血管前,经尾静脉缓慢推注0.3mg/kg的PI3K特异性抑制剂LY294002,余同尼可地尔组;5)L-NAME组(在结扎血管前,经尾静脉缓慢推注0.3mg/kg的NO合成酶抑制剂L-NAME,余同尼可地尔组)。2.不同处理组对心梗后小鼠生存率、心脏彩超的指标变化;3.通过CD31免疫荧光染色,在显微镜下观察缺血心肌组织的血管生成情况。4.番茄凝集素评估心梗后小鼠的微循环功能5.采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定心脏血浆中IL-1β、IL-6,NO以及ET-1的含量。6.通过Western Blot检测心肌缺血区域PI3K/Akt/eNOS的表达。体外试验-细胞部分:1.HHcy缺血/缺氧模型的建立:不同的HHcy浓度以及缺氧时间的摸索。分组为:24小时Hcy浓度0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L,缺氧时间分别为3h、6h、9h。2.采用噻唑蓝(Thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)法检测检测各组不同浓度Hcy和缺氧时间对冠脉内皮细胞生长的影响。采用乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)检测试剂盒检测各组心肌细胞LDH漏出率,3.采用Western-blotting法检测各组磷酸化eNOS蛋白的表达情况。4.不同浓度的尼克地尔对HHcy缺血/缺氧模型的保护。实验分组如下:1.control组;2.HHcy+Hypoxia 6h组;3.Nic0组(HHcy+Hypoxia6h+PBS组);4.Nic 50u M(HHcy+Hypoxia 6h+Nicorandil 50umol/L);5.Nic 100u M(HHcy+Hypoxia 6h+Nicorandil 100umol/L);6.Nic 125u M(HHcy+Hypoxia 6h+Nicorandil 125umol/L)。5.采用Western-blotting法检测各组PI3K/Akt/eNOS蛋白的表达情况,同时提取细胞上清液测定NO水平。6.q RT-PCR法检测IL-1β、IL-6m RNA表达水平的变化。7.PI3K抑制剂LY294002,eNOS抑制剂L-NAME预处理后,尼可地尔保护作用的改变,Western-blotting法检验P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-eNOS/eNOS的变化;8.划痕实验观察尼可地尔对内皮细胞迁移功能,小管成形观察实验尼可地尔对血管形成的影响。结果:1.HHcy心梗后小鼠生存率提高(P0.05),但是在PI3K抑制剂、eNOS抑制剂的作用下,尼可地尔的对HHcy心梗小鼠的生存率保护作用消失(P0.05);2.HHcy心梗后小鼠与正常组对比,LVEF、LVFS组下降,且LVIDd、LVIDs扩大,而尼可地尔的预处理可以使得心梗后小鼠的LVEF、LVFS值升高,同时缩小LVIDd、LVIDs(P0.05)。但在PI3K抑制剂、eNOS抑制剂的作用下,LVEF、LVFS,LVIDd、LVIDs值与HHcy心梗组无明显改善(P0.05);3.心肌组织CD31荧光染色,发现HHcy心梗组的荧光强度明显较其它各组少,而尼可地尔治疗组,荧光强度升高(P0.05),但在LY294002组、L-NAME组,荧光强度与HHcy心梗组无升高。4.番茄凝集素实验结果现实,尼可地尔组可以改善心梗后小鼠微循环功能,心梗后荧光强度较心梗组明显升高(P0.05),但在LY294002组、L-NAME组与HHcy心梗组对比无明显差异。5.与Sham组对比,HHcy心梗组的IL-1β、IL-6水平明显升高(P0.05),而尼可地尔的使用可以降低小鼠血浆中IL-1β、IL-6水平。6.HHcy心梗后小鼠血浆中的NO降低、ET-1水平升高;尼可地尔能够提提高NO水平、降低ET-1的水平(P0.05)。但在LY294002组、L-NAME组,磷酸化e NO的表达,NO、ET-1水平与HHcy心梗组无明显异(P0.05)。7.与Sham组相比,HHcy心梗后心肌缺血组织的磷酸化PI3K、Akt、eNOS值下降(P0.05);尼可地尔治疗后P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-eNOS/eNOS比值升高(P0.05);但是在LY294002组,P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-eNOS/eNOS与HHcy心梗组无区别(P0.05);在L-NAME组,PI3K/PI3K、P-Akt/Akt升高(P0.05),P-eNOS/eNOS仍降低。8.体外实验中,与正常组相比较,Hcy诱导的冠脉内皮细胞中细胞的活力随着Hcy浓度升高而逐渐降低,同时蛋白水平p-eNOS/eNOS的比例也下降(P0.05);而且随着缺氧时间的增长,细胞的活力也出现下降的趋势。而给予尼克地尔处理后,内皮细胞的活力增强(P0.05)、乳酸脱氢酶活性降低(P0.05)。9.与正常组相比,模型组NO水平明显下降,内皮细胞磷酸化的PI3K、Akt、eNOS的比值也降低(P0.05),而IL-1β、IL-6水平明显升高(P0.05)。尼克地尔随着浓度的升高对可以提高P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-eNOS/eNOS的比值升高(P0.05),升高NO水平(P0.05),减少细胞IL-1β、IL-6水平(P0.05)。10.当尼可地尔与PI3K抑制剂联合使用时,对细胞内Akt、eNOS的调控作用显著降低(P0.05);当尼可地尔与eNOS抑制剂联合使用时对PI3K、Akt的调控作用仍在,但其对eNOS的调控作用减弱。11.尼可地尔可以提高模型组细胞的迁徙功能,以及血管形成作用(P0.05)。但是当与PI3K抑制剂、eNOS抑制剂联合使用时,对细胞内皮功能的改变作用消失。结论:1.尼可地尔可以通过上调NO水平,降低炎症反应,改善HHcy对心梗后小鼠的微循环功能。2.尼可地尔通过激活PI3K/Akt/eNOS信号通路,从而发挥对缺血缺氧的保护的作用,从而改善内皮细胞功能。
【图文】：

心电图变化,血管,小动物

小动物结扎血管前后心电图变化

TTC染色,心脏,图形,前降支

未见明显异常颜色区域（图3）；模型组：心肌组织切片大部分区域呈砖红色，但均出现不同程度灰白色区域，出现部位在前室间隔偏左室处，与前降支血流供应区域相符，提示前降支梗死，大鼠前降支近段缺血模型建立成功。图 3：TTC 染色心脏不同切面的图形 (n=3)4.4 心功能测定心梗后 14 天行心脏超声检查示（表 1）：四组小鼠的心功能和 sham 组相比较明显下降，室壁运动减弱，心腔扩大，室壁厚度明显减少。而 HHcy+MI 的小鼠比 MI 组小鼠心功能相关指标要更差。LVEF 结果显示：与 Sham 组比较，其他各组的 LVEF 均明显降低（P＜0.05);Vehicle 组与 HHcy+MI 组组间比较无显著性差异（P>0.05）；但 HHcy+MI组与 MI 组相比明显下降(P＜0.05），叶酸组可改善 HHcy+MI 组的 LVEF 水平。LVFS 结果显示：与 Sham 组比较，，其他各组的 LVFS 均明显降低（P＜0.05)；Vehicle 组与 HHcy+MI 组之间比较无差异（P>0.05），HHcy+MI 组 LVFS 水平与 MI 组相比明显下降(P＜0.05），叶酸组治疗后 LVFS 也是明显升高（P＜0.05)。得到的各组趋势与 LVEF—致。LVIDd 结果显示：与 Sham 组相比较
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.4

【参考文献】