奥拉帕利对单核细胞动脉粥样硬化过程的影响及其与NLRP3炎症小体活性的关系

发布时间：2020-05-27 02:13

【摘要】：背景和目的NLRP3炎性小体的激活是动脉粥样硬化的主要发病因素。巨噬细胞摄取氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)激活NLRP3炎性小体,并随后分泌促炎介质和泡沫细胞形成。Poly(ADP-核糖)聚合酶(PARP)是DNA损伤的分子传感器,在许多真核细胞(包括单核/巨噬细胞)中存在丰富的PARP酶。有证据表明,PARP过度激活是致多种炎症性疾病包括动脉粥样硬化的有害因素。本研究旨在探讨1)Ox-LDL是否激活THP-1单核/巨噬细胞中PARP酶的活化;2)新近FDA批准的抗癌药物奥拉帕利(0l apar ib)通过抑制PARP是否减弱NLRP3炎性小体的活性和随后的促炎细胞因子的分泌、泡沫细胞形成和细胞的黏附;3)奥拉帕利介导的NLRP3炎性小体的抑制是否涉及NLRP3炎性小体激活的启动和激活的两个信号步骤。方法1.本课题的绝大部分实验是用被大家广泛应用的人单核巨噬细胞系THP-1细胞。THP-1细胞系悬浮培养于含10%FBS的RPMI 1640培养基,在37℃,5%CO2的条件下培养。THP-1细胞经或不经奥拉帕利、MCC950、Ox-LDL处理,而分为对照组、Olaparib组、MCC组、Ox-LDL 组、Olaparib+Ox-LDL 组、MCC+Ox-LDL 组、Olaparib+MCC+Ox-LDL 共七组。2.免疫蛋白印迹实验(Western blot)在本课题中被广泛应用于蛋白质表达的检测和半定量测定。3.酶联免疫吸附试验(ELISA)用来检测在NLRP3炎性小体激活后分至培养基中的白细胞介素IL-1 β和IL-18的量。4.油红0染料被用来评估泡沫细胞的形成。用福尔马林溶液固定后,用新鲜制备的油红0染料液对THP-1细胞进行染色。染色后的THP-1细胞在倒置显微镜下进行观察,并对拍摄的图像中的阳性泡沫细胞进行定量评估。5.细胞粘附试验被用来评价THP-1单核巨噬细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的粘附,这一体外实验与单核细胞粘附到血管内皮是相似的,单核巨噬细胞迁移到动脉粥样硬化病变部位是动脉粥样致病的早期步骤。6.常用于鉴定蛋白质相互作用共免疫沉淀(CO-IP)实验用于评估NF-κB活性的动态变化。免疫沉淀实验需要特异性的抗体及A/G亲和珠。结果1.氧化型低密度脂蛋白以剂量和时间依赖的方式增加NLRP3炎性小体组分(NLRP3、ASC、Caspase 1)和裂解型的PARP-1的蛋白表达。2.奥拉帕利通过抑制PARP而抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的裂解型PARP-1蛋白表达,而不抑制总PARP-1蛋白的表达。奥拉帕利还降低了氧化型低密度脂蛋白诱导的NLRP3炎性小体各组分(NLRP3、ASC、Caspase 1)的蛋白表达。与预期一致,MCC950降低氧化型低密度脂蛋白介导的NLRP3炎性小体各组分的蛋白表达,但单独的奥拉帕利或MCC950处理组与对照组相比,NLRP3活性的没有改变。3.氧化型低密度脂蛋白增加白细胞介素IL-1β和IL-18的蛋白表达;奥拉帕利降低氧化型低密度脂蛋白所介导的IL-1β和IL-18的蛋白表达,但单独奥拉帕利处理组与对照组相比,IL-1β和IL-18的蛋白表达没有改变。ELISA检测显示,氧化型低密度脂蛋白对IL-1 β和IL-18的分泌有明显的促进作用,而奥拉帕利显著降低了氧化型低密度脂蛋白介导的IL-1β和IL-18的分泌,但单独应用奥拉帕利,与对照组相比,IL-1β和IL-18的分泌没有改变。4.奥拉帕利显著降低了氧化型低密度脂蛋白介导的LOX-1和CD36清道夫受体的蛋白表达,但单独奥拉帕利处理组与对照组相比,清道夫受体的蛋白表达没有改变。与之相应,油红0染色实验显示奥拉帕利显著降低了氧化型低密度脂蛋白介导的泡沫细胞的形成,而单独的奥拉帕利或MCC950组与对照组相比,泡沫细胞的形成没有改变。5.奥拉帕利显著降低了氧化型低密度脂蛋白介导的VCAM-1蛋白的表达:而单独的奥拉帕利或MCC950组与对照组相比,VCAM-1蛋白的表达没有改变。与之相应,细胞粘附实验显示,奥拉帕利显著降低了氧化型低密度脂蛋白介导的单核细胞与HUVEC细胞的粘附,而单独的奥拉帕利或MCC950组与对照组相比,细胞与HUVEC细胞的粘附没有改变。6.流式细胞检测显示,氧化型低密度脂蛋白增加了 THP-1细胞的线粒体活性氧的生成。奥拉帕利显著降低了氧化型低密度脂蛋白介导的线粒体活性氧的增加。7.氧化型低密度脂蛋白增加了 IKK-α和磷酸化IκBα的蛋白表达,奥拉帕利显著降低了氧化型低密度脂蛋白介导的IKK-α和磷酸化IκBα的蛋白表达;而单独的奥拉帕利或MCC950组与对照组相比,IKK-α和磷酸化IκBα的蛋白表达没有改变。静息状态下,抗Iκ B α的抗体沉淀p65和p50,p65可被抗p50和抗Iκ B α所沉淀。奥拉帕利显著降低了氧化型低密度脂蛋白介导的I κ Bα与p65和p50的共免疫沉淀率,而奥拉帕利和氧化型低密度脂蛋白的单独或联合处理不影响p65与p50的免疫共沉淀。8.静息状态下,抗IκBα的抗体沉淀ReIB和p52,Rel B也可被抗p52和抗IκBα所沉淀。奥拉帕利处理组(Olaparib+Ox-LDL)降低了IKBα与ReIB和p52免疫共沉淀,而奥拉帕利和氧化型低密度脂蛋白的单独或联合处理不影响ReIB和P52的免疫共沉淀。结论1.氧化型低密度脂蛋白增加NLRP3炎症小体和PARP的活性,奥拉帕利通过抑制PARP而抑制氧化型低密度脂蛋白所介导的PARP和NLRP3炎症小体的活性。2.奥拉帕利对PARP的抑制作用而抑制氧化型低密度脂蛋白介导的IL-1β和IL-18蛋白的表达和分泌的增加。3.奥拉帕利对PARP的抑制作用而抑制氧化型低密度脂蛋白所诱导的泡沫细胞形成和单核细胞与内皮细胞的粘附。4.线粒体活性氧参与了奥拉帕利所介导的氧化型低密度脂蛋白对NLRP3炎性小体的激活。5.NF-κB的激活参与了奥拉帕利介导的NLRP3炎性小体抑制,其中典型和非经典途径均参与了奥拉帕利介导的对Ox-LDL增强NLRP3炎症小体活性的抑制。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5

【参考文献】