活化的β-catenin通过上调ECT2促进缺氧诱导多倍体心肌细胞胞质分裂的研究

发布时间：2020-06-07 14:43

【摘要】：研究背景与意义:心血管疾病导致心肌细胞死亡是最终引起心功能衰竭的根本原因。预防心肌细胞损伤和促进心肌再生是理想的措施。近年来关于心脏干细胞研究的质疑,使得心肌再生的研究陷入了困境。心肌肥厚性生长中,心肌细胞形成多核多倍体细胞。而胞质分裂障碍是关键原因,其确切机制尚不清楚。β-catenin是细胞周期调控的关键因子。有研究报道β-catenin能促进心肌细胞进入细胞周期,但β-catenin对胞质分裂的作用不清楚。本研究着重研究调控β-catenin对多倍体心肌细胞胞质分裂的作用及可能分子机制,探索多倍体心肌细胞在心肌损伤修复和再生中的作用。研究方法:第一部分:紫绀型与非紫绀型先心病患者心肌细胞的多倍体情况和细胞周期情况的差异研究本研究通过新桥医院伦理委员会批准。2014年10月至2016年10月在新桥医院心血管外科的20名符合纳入标准并同意参加本研究的患者(10名紫绀型先心病患者和10名非紫绀型先心病患者)纳入研究。诊断主要依据我院术前心脏彩超结果或CT结果,并在术中证实。纳入标准:需行右室流出道疏通术的先心病患者;四肢血氧饱和度(SpO2)差异≤2%;年龄18岁;排除多次行心脏手术和其他系统疾病。患者分组依据是术前未氧疗时动脉SpO2。SpO2≥95%的患者为非紫绀组,SpO2≤85%的患者为紫绀组。1.免疫荧光检测两组患者心肌细胞的核数和横截面积,pH3阳性、Aurora B阳性和kif20a阳性心肌细胞的情况。2.流式检测两组心肌细胞倍体数。第二部分:缺氧调节心肌细胞周期活性诱导多倍体化的初步机制研究建立动物缺氧模型:将12只8周大C57BL/6J雄性小鼠随机分为缺氧组(n=6)和常氧组(n=6)。缺氧组小鼠在缺氧仓(氧浓度为9.9%-10.1%)中饲养4周,常氧组在常氧下饲养4周。建立细胞缺氧模型:原代新生大鼠心肌细胞分为缺氧组(n=6)和常氧组(n=6)。缺氧组细胞置于缺氧细胞培养箱(94%N2,5%CO2,1%O2,37℃)培养48h。常氧组细胞置于细胞培养箱(74%N2,5%CO2,21%O2,37℃)培养48h。1.免疫荧光比较体外和体内实验两组心肌细胞倍体数、核数、核倍体数、多倍体分布情况,以及Ki67阳性、pH3阳性、Aurora B阳性和kif20a阳性心肌细胞的情况。2.流式检测体外和体内实验两组心肌细胞核的倍体数。第三部分:缺氧抑制β-catenin的基因调控活性参与缺氧心肌细胞多倍体化的机制研究建立动物缺氧模型和细胞缺氧模型。处理方法同第一部分。1.生物信息学分析找出多倍体和二倍体心肌细胞的差异基因,并进行GO分析和KEGG分析,找出可能的关键调控基因。2.Western Blot(WB)检测临床标本、体外和体内实验的两组β-catenin和HIF-1α的在胞核和胞浆的表达情况。免疫荧光验证β-catenin在胞核水平的变化。3.RT-qPCR检测体外和体内实验两组β-catenin下游靶基因cyclin d1的转录情况。4.免疫共沉淀检测体外实验缺氧组β-catenin,HIF-1α和TCF4三者的相互作用。第四部分:活化的β-catenin调控心肌细胞细胞周期活性促进心肌细胞二倍体化的初步研究建立动物干预模型:将18只8周大C57BL/6J雄性小鼠随机分为激动剂组(n=6),抑制剂组(n=6)和对照组(n=6)。在缺氧3周后,根据缺氧仓内小鼠体重,每天分别给激动剂组、抑制剂组和对照组小鼠腹腔内注射2 mg/kg的激动剂CHIR99021,1.75mg/kg的抑制剂IWR-1和等体积的DMSO,注射一周。建立细胞干预模型:按照感染复数为10计算合适的病毒量,将过表达腺病毒Adβ-catenin(过表达组),沉默腺病毒Adshβ-catenin(沉默组),空腺病毒AdGFP(对照组)转染至原代新生大鼠心肌细胞,再缺氧48h。1.WB检测β-catenin在胞核和胞浆的含量变化,验证体外和体内实验的干预效果。RT-qPCR检测β-catenin下游靶基因的转录情况。2.免疫荧光比较体外和体内实验心肌细胞倍体数、核数、核倍体数和多倍体分布情况、心肌细胞横截面积,以及Ki67阳性、pH3阳性、Aurora B阳性和kif20a阳性心肌细胞的情况。3.流式检测体外和体内实验心肌细胞核的倍体数。4.CCK8和心肌细胞计数分别检测体外和体内实验心肌细胞数量变化。5.小动物心导管检测小鼠心脏功能变化。第五部分:活化的β-catenin上调ECT2促进四倍体心肌细胞胞质分裂参与心肌再生的机制研究建立动物干预模型和细胞干预模型。处理参照第四部分。1.WB和RT-qPCR分别检测Ect2的转录和表达情况。2.生物信息学预测Ect2非编码区上TCF4的结合位点,染色体免疫共沉淀-qPCR(ChIP-qPCR)验证TCF4在Ect2非编码区的结合位点。3.免疫荧光检测ECT2,Anillin和MgcRacGAP三者的定位情况,明确ECT2对Anillin的作用。4.流式检测分选的四倍体心肌细胞的倍体数。研究结果:第一部分:紫绀型与非紫绀型先心病患者心肌细胞的多倍体情况和细胞周期情况的差异研究1.收集患者的一般情况:非紫绀组(4名男性,6名女性)性别组成和紫绀组(5名男性,5名女性)无统计学差异(P0.05)。紫绀组年龄(6.65±8.83岁)和非紫绀组(3.52±3.6岁)无统计学差异(P0.05)。非紫绀组血氧饱和度高于紫绀组(97.50±1.63%vs 68.57±11.37%,P0.05)2.紫绀组心肌细胞的平均细胞核数多于非紫绀组(1.29±0.20 vs 1.03±0.01,P0.05);紫绀组心肌细胞的平均倍体数多于非紫绀组(3.61±0.03c vs 2.28±0.18c,P0.05);紫绀组心肌细胞的平均核倍体数大于非紫绀组(2.34±0.09c vs 2.04±0.05c,P0.05);紫绀组心肌细胞的横截面积大于非紫绀组(相对于非紫绀组的相对面积1.64±0.10 vs 0.98±0.10,P0.05)。3.紫绀组pH3阳性心肌细胞比例高于非紫绀组(11.38±2.41%vs 2.64±1.69%,P0.05);紫绀组Aurora B阳性心肌细胞比例与非紫绀组无明显差异(0.38±0.44%vs0.10±0.25%,P0.05);紫绀组kif20a阳性心肌细胞比例与非紫绀组无明显差异(0.19±0.24%vs 0.44±0.36%,P0.05)。第二部分:缺氧调节心肌细胞周期活性诱导多倍体化的初步机制研究1.动物缺氧实验的情况:缺氧组心脏重量与体重比值大于常氧组(5.22±0.48 vs4.38±0.08 mg/g,P0.05),而心脏重量与胫骨长度比值小于常氧组(3.63±0.32 vs 4.73±0.42 mg/mm,P0.05)。缺氧组肺脏重量与体重的比值大于常氧组(9.44±0.33 vs 6.01±0.14 mg/g,P0.05),肺脏重量与胫骨长度的比值与常氧组无明显差异(6.55±0.21 vs 6.48±0.58 mg/mm,P0.05)。2.动物缺氧实验中,缺氧组心肌细胞的平均细胞核数多于常氧组(2.04±0.09 vs1.64±0.09,P0.05);缺氧组心肌细胞的平均倍体数多于常氧组(4.96±0.37c vs 3.40±0.47c,P0.05);缺氧组心肌细胞的平均核倍体数多于常氧组(2.96±0.05c vs 2.48±0.04c,P0.05)。缺氧组心肌细胞的横截面积比常氧组大(相对于常氧组的相对面积1.91±0.28 vs 0.95±0.25,P0.05);缺氧组Ki67阳性心肌细胞比例高于常氧组(5.15±1.78%vs 1.04±1.61%,P0.05);缺氧组pH3阳性心肌细胞比例高于常氧组(1.28±0.56%vs 0±0%,P0.05);缺氧组Aurora B阳性心肌细胞比例与常氧组无明显差异(0±0%vs 1.87±3.23%,P0.05);缺氧组kif20a阳性心肌细胞比例与常氧组无明显差异(0.45±0.91%vs 0.93±1.07%,P0.05)。3.细胞缺氧实验中,缺氧组心肌细胞的平均细胞核数多于常氧组(1.16±0.06 vs1.04±0.03,P0.05);缺氧组心肌细胞的平均倍体数多于常氧组(6.05±0.71c vs 4.55±0.19c,P0.05);缺氧组心肌细胞的平均核倍体数多于常氧组(2.20±0.07c vs 2.02±0.03c,P0.05)。缺氧组心肌细胞的横截面积比常氧组大(相对于常氧组的相对面积1.61±0.23 vs 1.00±0.10,P0.05);缺氧组Ki67阳性心肌细胞比例高于常氧组(18.81±11.37%vs 6.99±3.32%,P0.05);缺氧组pH3阳性心肌细胞比例高于常氧组(6.67±4.3%0 vs 2.29±2.47%,P0.05);缺氧组Aurora B阳性心肌细胞比例与常氧组无明显差异(0±0%vs 0.55±1.75%,P0.05);缺氧组kif20a阳性心肌细胞比例与常氧组无明显差异(0±0%vs 0.28±0.85%,P0.05)。第三部分:缺氧抑制β-catenin的基因调控活性参与缺氧心肌细胞多倍体化的机制研究1.多倍体心肌细胞与二倍体比有420个差异基因,功能集中在细胞周期和细胞分裂。β-catenin调控约1/5的细胞周期和细胞分裂的基因。2.临床标本上,紫绀组胞核内β-catenin的含量高于非紫绀组(0.74±0.17 vs 0.42±0.12,P0.05);紫绀组胞核内HIF-1α的含量高于非紫绀组(0.71±0.06 vs 0.33±0.05,P0.05)。3.动物缺氧实验中,缺氧组胞核内β-catenin的含量高于常氧组(2.86±0.57 vs 0.98±0.29,P0.05);缺氧组胞核内HIF-1α的含量高于常氧组(2.79±0.96 vs 0.82±0.53,P0.05);缺氧组Cyclin D1转录水平与常氧组无明显差异(0.85±0.25 vs 1.01±0.08,P0.05)。4.细胞缺氧实验中,缺氧组胞核内β-catenin的含量高于常氧组(1.04±0.11 vs 0.43±0.19,P0.05);免疫荧光提示β-catenin定位在胞核。缺氧组Cyclin D1转录水平与常氧组无明显差异(0.92±0.11 vs 1.01±0.11,P0.05)。5.缺氧下,β-catenin与HIF-1α的结合比与TCF4明显(相对于HIF-1α结合组的灰度值1.00±0.16 vs 0.37±0.09,P0.05)。第四部分:活化的β-catenin调控心肌细胞细胞周期活性促进心肌细胞二倍体化的初步研究1.在体外实验,β-catenin过表达组核内β-catenin含量高于β-catenin沉默组和对照组(1.20±0.11 vs 0.53±0.08 vs 0.77±0.10,P0.05);β-catenin过表达组Cyclin D1转录水平高于β-catenin沉默组和对照组(4.53±0.90 vs 1.19±0.40 vs 0.97±0.13,P0.05)。2.在体内实验,β-catenin激动剂组核内β-catenin含量高于β-catenin抑制剂组和对照组(1.17±0.10 vs 0.85±0.21 vs 0.71±0.12,P0.05);β-catenin激动剂组Cyclin D1转录水平高于β-catenin抑制剂组和对照组(3.72±0.45 vs 0.99±0.30 vs 1.15±0.25,P0.05)。3.在体外实验,β-catenin过表达组心肌细胞的平均细胞核数低于β-catenin沉默组和对照组(1.07±0.04 vs 1.25±0.09 vs 1.22±0.09,P0.05);β-catenin过表达组心肌细胞的平均倍体数低于β-catenin沉默组和对照组(2.33±0.05c vs 4.77±0.09c vs 4.01±0.12c,P0.05);β-catenin过表达组心肌细胞的平均核倍体数低于β-catenin沉默组和对照组(2.02±0.03c vs 2.23±0.08c vs 2.19±0.14c,P0.05);β-catenin过表达组心肌细胞的大小与对照组没有明显区别(0.91±0.29 vs 1.73±0.41 vs 0.99±0.08,P0.05);β-catenin过表达组Ki67阳性心肌细胞比例高于β-catenin沉默组和对照组(48.14±19.07%vs 4.34±4.86%vs 8.23±6.38%,P0.05);β-catenin过表达组p H3阳性心肌细胞比例高于β-catenin沉默组和对照组(35.92±12.89%vs 2.30±2.97%vs 3.95±4.60%,P0.05);β-catenin过表达组Aurora B阳性心肌细胞比例高于β-catenin沉默组和对照组(8.27±3.64%vs 1.46±2.70%vs 0.33±0.98%,P0.05);β-catenin过表达组kif20a阳性心肌细胞比例高于β-catenin沉默组和对照组(4.26±1.08%vs 0.24±0.68%vs 0.18±0.52%,P0.05);β-catenin过表达组心肌细胞数量多于β-catenin沉默组和对照组(CCK8的OD为0.82±0.06 vs 0.68±0.03 vs 0.66±0.03,P0.05)。4.在体内实验,β-catenin激动剂组心肌细胞的平均细胞核数低于β-catenin抑制剂组和对照组(1.96±0.06 vs 2.13±0.07 vs 2.15±0.17,P0.05);β-catenin激动剂组心肌细胞的平均倍体数低于β-catenin抑制剂组和对照组(4.69±0.61c vs 6.19±0.61c vs 6.19±0.59c,P0.05);β-catenin激动剂组心肌细胞的平均核倍体数低于β-catenin抑制剂组和对照组(2.38±0.07c vs 2.61±0.10c vs 2.91±0.10c,P0.05);β-catenin激动剂组心肌细胞的大小与对照组无统计学差异(0.77±0.13 vs 1.12±0.17 vs 1.12±0.23,P0.05);β-catenin激动剂组Ki67阳性心肌细胞比例高于β-catenin抑制剂组和对照组(17.16±3.43%vs 5.04±1.00%vs 2.95±2.76%,P0.05);β-catenin激动剂组p H3阳性心肌细胞比例高于β-catenin抑制剂组和对照组(32.51±13.27%vs 12.78±5.93%vs6.44±3.57%,P0.05);β-catenin激动剂组Aurora B阳性心肌细胞比例高于β-catenin抑制剂组和对照组(1.90±0.15%vs 0±0%vs 0±0%,P0.05);β-catenin激动剂组kif20a阳性心肌细胞比例高于β-catenin抑制剂组和对照组(1.42±0.34%vs 0±0%vs 0±0%,P0.05);β-catenin激动剂组心肌细胞数量多于β-catenin抑制剂组和对照组(12.80±1.10*106 vs 9.80±0.41*106 vs 10.53±0.22*106,P0.05);β-catenin激动剂组心脏射血分数高于β-catenin抑制剂组和对照组(58.15±3.19%vs 45.04±3.23%vs53.22±2.23%,P0.05)。第五部分:活化的β-catenin上调ECT2促进四倍体心肌细胞胞质分裂参与心肌再生的机制研究1.体外实验中,β-catenin过表达组胞核内ECT2含量高于β-catenin沉默组和对照组(1.42±0.15 vs 0.34±0.02 vs 0.13±0.02,P0.05);体外实验中,β-catenin过表达组ECT2转录水平高于β-catenin沉默组和对照组(2.87±0.33 vs 0.79±0.13 vs 1.05±0.18,P0.05);体内实验中,β-catenin激动剂组胞核内ECT2含量高于β-catenin抑制剂组和对照组(1.99±0.17 vs 1.16±0.06 vs 0.85±0.12,P0.05);体内实验中,β-catenin激动剂组ECT2转录水平高于β-catenin抑制剂组和对照组(3.03±0.52 vs 0.92±0.46 vs1.02±0.18,P0.05)。2.TCF4在Ect2第一内含子内有结合位点。3.体外实验中,β-catenin过表达组ECT2与Anillin共定位于肌动蛋白收缩环的比例高于β-catenin沉默组和对照组(3.60±4.87%vs 0±0%vs 0±0%,P0.05);β-catenin过表达组ECT2与Mgc Rac GAP共定位于肌动蛋白收缩环的比例高于β-catenin沉默组和对照组(2.76±3.77%vs 0±0%vs 0±0%,P0.05)。4.在分选的四倍体心肌细胞,β-catenin激动剂组心肌细胞平均倍体数低于对照组(2.93±0.12c vs 2.90±0.07c,P0.05)。研究结论:1.与非紫绀组比,紫绀组心肌细胞明显多倍体化,以多核化为主;心肌细胞的S期活性增高,G2/M期和胞质分裂活性无明显增高。2.缺氧情况下,β-catenin入胞核,与HIF-1α结合,β-catenin活性受到抑制,进而引起心肌细胞的G1/S期活性增加,而不改变G2/M期和胞质分裂活性,诱导多核多倍体心肌细胞产生。3.缺氧情况下,活化的β-catenin通过上调ECT2,促进ECT2与Anillin结合,正确定位于肌动蛋白收缩环,促进多倍体心肌细胞胞质分裂。
【图文】：

的分子机制（见图 1.1）。在第二章中，通过比较紫绀型先心病患者与非紫绀患者倍体数、核数和细胞周期活性，并初步探讨相关机制。在第三章中，通离体的心肌细胞和在体小鼠心肌进行干预，观察倍体数、核数和细胞周期活步确认缺氧对心肌细胞多倍体化的诱导作用及初步诱导机制。第四章节，通息学分析筛选促进心肌细胞增殖的蛋白，发现 β-catenin 可能具有促进心肌细作用，进一步探讨其在缺氧过程中活性抑制的分子机制。第五章中，通过atenin 活性，观察慢性缺氧下心肌细胞倍体数、核数和细胞周期活性的变化，atenin 对心肌细胞增殖的调节作用，进一步探讨 β-catenin 与心肌细胞胞质分裂。在第六章中，通过增加四倍体心肌细胞的 β-catenin 活性，观察四倍体心肌、核数和胞质分裂的情况，进一步探索 β-catenin 与心肌细胞胞质分裂的关键llin 和 ECT2 蛋白三者之间的调控关系，最终确认 β-catenin 影响多倍体心肌细裂的分子机制。

陆军军医大学博士学位论文Ki67 阳性和 pH3 阳性的心肌细胞核，是在共聚焦显微镜用层扫技术拍照后，细所在的平面上 Ki67 阳性和 pH3 阳性分别与心肌细胞核信号共定位。Aurora B 阳 kif20a 阳性的心肌细胞核，是相邻两细胞核所在的平面上 Aurora B 阳性和 kif2性信号分别定位两个心肌细胞核信号之间。心肌细胞核，是细胞核信号完全被包裹在 Troponin T 抗体信号之内，且未与 WG记的细胞膜信号相邻[26]（见图 2.1）。由 WGA 染色标记的细胞膜信号包裹的 Troponin T 阳性的细胞是心肌细胞，，WG号包围的面积为心肌细胞大小。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54


本文编号：2701574