低剂量西达本胺通过调节nTreg与CTLA4表达诱导ITP免疫耐受的研究

发布时间：2020-06-09 07:26

【摘要】：原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是临床最为常见的自身免疫性出血性疾病。ITP的主要发病机制:1.患者对自身抗原的免疫失耐受:2.体液和细胞免疫介导的血小板破坏过多;3.巨核细胞数量和质量异常导致血小板产生不足。4.CD4+CD25+Foxp3+自然调节性 T 细胞(natural regulatory T cell,nTreg)可抑制 T细胞增殖与扩增,为维持免疫耐受状态所必需,其数量及功能下降在ITP发病机制中发挥了重要作用。近年来大量研究发现,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)具有免疫调节活性,低剂量HDACi可以抑制幼年特发性关节炎患者1和炎症性肠病、结肠炎动物模型炎症反应,调节免疫细胞因子活性;低剂量组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)亦可以上调Foxp3+自然调节性T细胞数量与功能,减轻移植物抗宿主病(GVHD)反应2。然而目前,尚无研究证实组蛋白去乙酰化酶抑制剂在ITP中是否具有上述作用。本研究以ITP主动模型鼠为研究对象,给予低剂量组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)西达本胺治疗,采用流式细胞学方法检测ITP动物模型小鼠脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+自然调节性T细胞(nTreg)细胞比例。研究发现,低剂量HDACi治疗可显著升高ITP动物模型外周血血小板水平。进一步研究发现,低剂量HDACi治疗后ITP动物模型脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+自然调节性T细胞数量及比例取得了明显升高。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA4)又称CD152,表达于活化的调节性T细胞胞内及胞膜膜表面,CTLA4与CD28分子高度同源,二者均可以与B7分子结合,CTLA4与B7分子结合后将降低T细胞应答,阻断T细胞活化的共刺激通路,对T细胞活化产生负调控作用。本研究在前期研究基础上,采用流式细胞术检测了 HDACi西达本胺治疗后ITP动物模型脾细胞中CD4+T细胞膜表面CTLA4表达。采用QT-PCR技术检测ITP动物模型小鼠脾细胞CTLA4基因mRNA表达情况。研究发现,HDACi西达本胺治疗显著提高了 ITP动物模型脾细胞中CD4+T细胞膜表面CTLA4表达。QT-PCR结果显示,低剂量HDACi西达本胺治疗后主动ITP模型小鼠脾细胞CTLA4基因mRNA表达水平显著上升。随后本研究以ITP患者及健康对照组为研究对象,分离外周血单个核细胞(PBMC),体外培养,给予低剂量西达本胺干预,检测CD4+CD25+Foxp3+Treg 比例,检测低剂量西达本胺对外周血PBMC培养体系中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的影响。然后,本研究采用免疫磁珠方法分选CD4+CD25+Treg细胞及CD4+CD25-效应T细胞,给予低剂量西达本胺治疗,检测低剂量西达本胺治疗后,CD4+CD25+Treg细胞对效应T细胞增殖的抑制作用。另外,本研究进一步探讨了 ITP患者单核细胞培养体系西达本胺治疗前后CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞CTLA4表达情况。研究发现,低剂量西达本胺可显著提高ITP患者外周血PBMC培养体系中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例及数量。低剂量西达本胺可显著促进ITP患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞CTLA4的表达。低剂量西达本胺可显著提高ITP患者CD4+CD25+Treg细胞对效应T细胞增殖的抑制作用,即提高了 CD4+CD25+Treg细胞对效应T细胞的免疫抑制作用。最后,本研究采用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术检测ITP患者与正常对照组外周血单个核细胞CTLA4基因组蛋白H3K27乙酰化水平,发现ITP患者PBMC组蛋白H3K27乙酰化水平较正常对照显著降低。将ITP患者单个核细胞进行分离,体外培养,给予低剂量西达本胺治疗,发现低剂量西达本胺可显著提高ITP患者PBMCs组蛋白H3K27乙酰化水平。综上所述,低剂量西达本胺可促进ITP动物模型CD4+CD25+Foxp3+nTreg细胞生成,提高ITP动物模型外周血血小板水平;促使ITP患者外周血T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞转化,增强ITP患者Treg细胞免疫抑制功能。进一步研究发现,ITP患者外周血单个核细胞(PBMC)CTLA4基因组蛋白H3K27乙酰化水平较正常对照显著降低,该异常可能导致了 CTLA4基因表达水平下降,患者免疫耐受性下降,参与ITP的发病过程。低剂量西达本胺可上调ITP患者外周血单个核细胞CTLA4基因乙酰化组蛋白H3K27水平,诱导免疫耐受。因此低剂量西达本胺可应用于ITP的临床治疗,有望改善ITP患者的预后。第一部分低剂量西达本胺对ITP主动模型的治疗作用及对CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞生成、CTLA4基因表达的影响研究目的:研究低剂量HDACi对ITP动物模型是否具有治疗作用。检测HDACi治疗后ITP动物模型脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+nTreg细胞数量、细胞比例,以及CD4+T细胞膜表面CTLA4表达,以进一步发现HDACi对ITP的具体作用机制。研究方法:1.构建ITP主动模型小鼠,随机分为对照组与西达本胺治疗组,对照组给予磷酸缓冲盐溶液(PBS)灌胃,治疗组给予低剂量西达本胺(0.1mg/kg)灌胃。每周检测1次小鼠外周血血常规。2.建模4周后处死小鼠,制备小鼠脾细胞悬液,采用流式细胞检测方法检测小鼠脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+自然调节性T细胞(nTreg细胞)比例,检测CD4+T细胞中CTLA4表达情况。采用QT-PCR方法检测小鼠脾细胞CTLA4 mRNA表达情况。研究结果:1.低剂量西达本胺显著提高了 ITP动物模型外周血血小板水平,降低出血相关死亡率,改善ITP动物模型的总生存。2.低剂量西达本胺显著提高了 ITP动物模型脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+自然调节性T细胞数量及比例。3.低剂量西达本胺显著提高了 ITP动物模型脾细胞中CD4+T细胞中CTLA4表达。4.低剂量西达本胺显著上调了 ITP动物模型脾细胞CTLA4基因表达。研究结论:低剂量西达本胺对主动模型ITP小鼠具有显著的治疗作用,可上调nTreg数量与比例,上调CTLA4表达,从而促进免疫耐受。第二部分:低剂量西达本胺对ITP患者Treg细胞生成、CTLA4表达、及对Treg细胞免疫抑制功能的作用研究研究目的:研究HDACi对ITP患者外周血PBMC培养体系中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞生成及CD4+CD25+Treg细胞免疫抑制功能的影响。研究低剂量西达本胺对CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞表达 CTLA4 的影响。研究方法:1.采集ITP患者及健康对照组的外周血,并分离PBMC细胞。2.以植物血凝素、IL-2刺激淋巴细胞体外生长,建立PBMC细胞体外培养体系。3.将ITP患者与健康对照组PBMC细胞与低剂量西达本胺共培养,收集细胞用于流式检测。4.以PEcy5-CD4、FITC-CD25、APC-Foxp3单克隆抗体标记Treg细胞,流式细胞术检测PBMC细胞中CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞比例。5.以 PEcy5-CD4、FITC-CD25、APC-Foxp3 单克隆抗体标记 Treg 细胞,以PE-CTLA4单克隆抗体标记CTLA4,流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+TregTM细胞CTLA4表达情况。6.以免疫磁珠方法分选CD4+CD25+Treg细胞及CD4+CD25-效应T细胞,给予低剂量西达本胺治疗,检测CD4+CD25+ Treg细胞对效应T细胞增殖的抑制作用。研究结果:1.低剂量西达本胺可显著提高ITP患者外周血PBMC培养体系中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例及数量。2.低剂量西达本胺可显著促进ITP患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞CTLA4的表达。3.低剂量西达本胺可显著增强CD4+CD25+Treg细胞对效应T细胞增殖的抑制作用,即提高CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制作用。研究结论:低剂量西达本胺可显著提高ITP患者外周血PBMC培养体系中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例及数量;促进ITP患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞CTLA4的表达;提高CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制作用,从而促进免疫耐受。第三部分:低剂量西达本胺调节CTLA4基因组蛋白H3K27乙酰化水平诱导ITP患者免疫耐受研究目的:研究ITP患者及健康对照组外周血PBMC中CTLA4基因组蛋白H3K27乙酰化水平。然后,将ITP患者外周血PBMC分离并体外培养,给予低剂量西达本胺治疗,检测HDACi对ITP患者外周血PBMC培养体系中CTLA4基因组蛋白H3K27乙酰化水平的影响。研究方法:1.采集ITP患者及正常对照组的外周血,并分离PBMC细胞。2.采用染色质免疫共沉淀(ChIP)方法检测ITP患者及健康对照组PBMC细胞CTLA4基因组蛋白H3K27乙酰化水平。3.将ITP患者PBMC体外培养,给予低剂量西达本胺干预,采用染色质免疫共沉淀(ChIP)方法检测西达本胺治疗前后PBMC细胞CTLA4基因组蛋白H3K27乙酰化水平。研究结果:1.ITP患者PBMC细胞CTLA4基因组蛋白H3K27乙酰化水平较健康对照显著降低。2.西达本胺治疗可显著提高ITP患者外周血PBMC细胞CTLA4基因组蛋白H3K27乙酰化水平,提高ITP患者外周血PBMC细胞CTLA4表达,促进免疫耐受。研究结论:1.ITP患者PBMC细胞组蛋白H3K27乙酰化水平较健康对照显著降低。该异常可能导致了 CTLA4基因表达水平下降,患者免疫耐受性下降,参与ITP的发病过程。2.西达本胺可上调ITP患者单个核细胞CTLA4基因组蛋白H3K27乙酰化水平,纠正ITP患者CTLA4基因组蛋白H3K27乙酰化异常,诱导免疫耐受。3.西达本胺可以应用于ITP的临床治疗,有望改善ITP患者的预后。
【图文】：

图１：低剂量西达本胺治疗明显提高了主动ＩＴＰ模型鼠外周血血小板水平。主动模型小鼠在建模同时给予低剂量西达本胺治疗。建模第７天，主动ＩＴＰ模型小鼠治血小板水平明显高于对照组，但是差异无统计学意义（３１９．２邋±邋４７．４邋ｘ邋１０９／Ｌ邋ｖ＾．邋２６６．５Ｍ０９／Ｌ，治疗组ｎ＝１２，对照组ｎ＝１０，尸＞０．０５）。建模第１４天，两组血小板水至最低，，两组比较治疗组血小板水平显著高于对照组，差异有统计学意义（］６６．４±邋ｘ邋ｌ0９／Ｌ邋ｗ．邋７６．２５邋±邋３０．８８邋ｘ邋１0９／ｌ，治疗组邋ｎ邋＝邋１１，对照组邋ｎ邋＝邋８，尸邋＜邋０．０５）；第邋２１邋天，组血小板水平均有轻度上升，治疗组血小板仍显著高于对照组，差异有统计学（３１９．１邋±６１．７１邋ｘ邋ｉ0９／ｌＶｉＳ．邋１４７．】邋±５６．６４邋ｘ邋１0９几，治疗组邋ｎ＝邋１１，对照组邋ｎ邋＝邋７，尸邋＜０．０

图２：低剂量西达本胺治疗明显增加了主动ＩＴＰ模型小鼠脾细胞中ＣＤ４＋ＣＤ２５＋调节Ｔ逡逑细胞水平及ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋调节Ｔ细胞水平。低剂量西达本胺治疗４周，主动丨ＴＰ逡逑模型鼠ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ细胞比例及数量均有显著上升，差异有统计学意义（治疗组；逡逑８＿２５５邋±２．４２１％低对照组邋３．５８２±０＿５０８％，治疗组１１＝１１，对照组１１邋＝邋５，／＞＜０．０５，？４逡逑２Ａ）。与ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ细胞相一致，低剂量西达本胺治疗４周，主动ＩＴＰ模型鼠逡逑ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ细胞比例及数量均显著上升，差异有统计学意义（治疗组３．３４６逡逑±０．３９８％ｕｓ．邋１．９８９邋±０．３０１％，治疗组邋ｎ＝邋１１，对照组邋ｎ邋＝邋５，尸＜邋０．０５，邋Ｆｉｇ邋２Ｂ邋ａｎｄ邋２Ｃ）逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R558.2

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本文编号：2704357