GDF1转录调控机制及miR-132对FSH调控颗粒细胞合成孕酮影响的初步研究

发布时间：2020-06-14 00:34

【摘要】：先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)是胚胎发育过程中心脏和血管结构性异常引起的一类心血管疾病,也是我国排名首位的出生缺陷类型。先天性心脏病的发生和发展是遗传和环境共同作用的结果。GDF1在胚胎左右轴不对称的建立及心脏环化中发挥重要作用,GDF1突变与CHD的发生密切相关,但对GDF1转录调控机制研究罕见报道。GDF1由一个保守的双顺反子mRNA编码,该mRNA含有GDF1和Cers1两个编码区,其中Cers1位于GDF1上游。我们实验室前期已经证实Cers1翻译起始位点ATG(+1)上下游-608/+71区域包含GDF1启动子序列。使用转录因子结合软件PROMO和JASPAR进行生物信息学分析,我们发现GDF1启动子序列含有三个潜在的NKE位点,NKE位点是NK类同源域蛋白在DNA上的结合元件。Nkx2.5作为肌源性谱系发育所必需的NK类同源异型结构域蛋白NK-2成员之一,在心脏发育中具有重要作用,其突变可导致多种CHD表型,因此我们推测转录因子Nkx2.5可能调控GDF1的表达,并进一步通过实验进行了鉴定。我们利用pcDNA3.1-myc-His空载体和pcDNA3.1-myc-Nkx2.5表达质粒与pGL3-GDF1启动子报告质粒共转染HEK293ET细胞,双荧光报告基因实验检测GDF1启动子活性,发现Nkx2.5过表达激活了 GDF1启动子的活性。用pcDNA3.1-myc-His空载体和pcDNA3.1-myc-Nkx2.5表达质粒分别转染HEK293ET细胞24h后,Real-time PCR结果显示Nkx2.5过表达显著升高GDF1 mRNA的水平,Western Blot结果显示Nkx2.5过表达显著增加GDF1蛋白水平。利用对照重组腺病毒和重组腺病毒Ad-Nkx2.5分别感染H9c2心肌细胞24h后,Western Blot结果显示Nkx2.5过表达显著上调GDF1蛋白水平。斑马鱼Dvr1基因是哺乳动物GDF1的同源基因。我们以脊椎动物模式生物斑马鱼为模型,利用morpholino技术敲低Nkx2.5基因,整胚原位杂交和Real-time PCR结果均显示Nkx2.5敲低显著降低了斑马鱼胚胎Dvr1的转录水平,而Nkx2.5过表达则逆转斑马鱼Dvr1转录水平的下调。这些结果表明Nkx2.5能转录激活GDF1的表达。我们进一步鉴定Nkx2.5在GDF1启动子区结合位点。生物信息学分析发现三个潜在NKE位点分别位于GDF1启动子区域-517、-440和-203位置。我们以野生型GDF1启动子区域-608/+71为骨架分别构建了针对-517、-440和-203位置的三个突变报告质粒,将野生型和突变型报告质粒分别转染HEK293ET和H9c2细胞,双荧光报告基因活性检测表明在两种细胞中-517结合位点的突变都显著抑制GDF1启动子活性,而-440或-203位点突变的抑制作用较弱或无明显作用。因此,我们侧重研究了-517位点在Nkx2.5调控GDF1中的作用。利用pcDNA3.1-myc-NKX2.5转染HEK293ET细胞后提取核蛋白,分别与复性生物素标记的-517位点野生型和突变型的双链寡核苷酸探针进行DNA pulldown分析。结果表明,突变的-517结合位点与Nkx2.5蛋白的结合能力较野生型-517结合能力显著下降。随后利用野生型GDF1启动子报告质粒和-517结合位点突变的报告质粒以及不同浓度的pcDNA3.1-myc-Nkx2.5表达质粒共转染HEK293ET和H9c2细胞。双荧光报告基因检测结果表明,在两种细胞中Nkx2.5过表达均导致野生型GDF1启动子活性呈剂量依赖性显著增加,而-517结合位点突变后,Nkx2.5的激活效应均降低约70%并且不受剂量梯度影响。利用pcDNA3.1-myc-Nkx2.5转染HEK293ET细胞后,利用Myc抗体进行染色质免疫沉淀实验,Real-time PCR检测结果表明与对照血清相比,以Myc抗体免疫沉淀物为模板能显著扩增含有-517位点的启动子区域,表明Nkx2.5在体内能与GDF1启动子结合。综上所述,我们发现Nkx2.5过表达激活GDF1启动子的活性并上调GDF1的表达。Nkx2.5敲低显著降低了哺乳动物GDF1在斑马鱼中的同源基因Dvr1的转录水平,而Nkx2.5过表达则逆转这种效应。进一步的机制研究发现Nkx2.5能通过-517位点调控GDF1的表达。以上研究结果表明GDF1是Nkx2.5的一个新颖靶基因。此外,我们实验室前期用miRNA芯片技术对卵泡刺激素(FSH)刺激孕酮合成前后的大鼠原代培养颗粒细胞进行分析,发现31个表达差异的miRNA,其中miR-132是受FSH调控变化幅度差异最显著的基因之一。我们随后对miR-132在FSH介导的颗粒细胞合成孕酮中的作用进行了初步探究。用50ng/ml FSH处理原代颗粒细胞后进行Real-time PCR检测,发现FSH处理不同时间点,miR-132的表达水平显著上调。利用对照重组腺病毒和重组腺病毒Ad-miR132感染原代颗粒细胞,Real-time PCR检测结果表明感染Ad-miR132后miR-132表达水平显著增加。利用对照重组腺病毒和Ad-miR132感染原代颗粒细胞后再经FSH处理,放射免疫法检测结果表明,感染Ad-miR132后显著增加了 FSH介导的颗粒细胞孕酮合成。文献报道Foxo3a在卵泡发育中发挥重要作用,已知Foxo3a是miR-132的下游靶基因。我们用Western Blot检测FSH处理颗粒细胞Foxo3a的表达,结果显示FSH处理不同时间点,Foxo3a表达呈现逐渐下降的趋势,提示miR-132可能在颗粒细胞中负调控Foxo3a的表达。以上研究结果表明miR-132对FSH介导的颗粒细胞孕酮合成有促进作用。 【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.1

【图文】：

启动子活性,内参,萤火虫荧光素酶,质粒

其中ｐＲＬ－ＴＫ为内参。结果显示，，与共转染空载体和ｐＧＬ３－ＧＤＦｌ启逡逑动子报告质粒对照组相比，Ｎｋｘ２．５过表达导致ＧＤＦ１启动子活性显著增加约３逡逑倍（图１－１），提示Ｎｋｘ２．５能够激活ＧＤＦ１的启动子活性。逡逑６．０－１逡逑Ｉ－邋｜｜逡逑ｍ逡逑｜邋２．０－逡逑％．0１0Ｊ（Ｌ逡逑Ｖｅｃｔｏｒ邋ＮＫｘ２．５逡逑图１－１邋Ｎｋｘ２．５对ＧＤＦ１启动子活性的影响。ｐＧＬ３－ＧＤＦｌ启动子报告质粒与逡逑ｐｃＤＮＡ３．１－ｍｙｃ－Ｈｉｓ邋空载体或邋ｐｃＤＮＡ３．１－ｍｙｃ－Ｎｋｘ２．５邋表达质粒共转染邋ＨＥＫ２９３ＥＴ邋细胞邋２４ｈ邋后，逡逑进行双荧光素酶活性检测。以ｐＲＬ－ＴＫ邋（萤火虫荧光素酶活性）作为内参。星号表示与对照逡逑３４逡逑

柱状图,鱼胚,斑马鱼

逡逑图１４邋Ｎｋｘ２．５对ＧＤＦ１蛋白水平的影响。（Ａ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ检测重组腺病毒Ａｄ－Ｃｔｒｌ和逡逑Ａｄ－Ｎｋｘ２．５分别感染Ｈ９ｃ２细胞２４ｈ后Ｎｋｘ２．５、ＧＤＦ１的蛋白表达水平；（Ｂ）邋ＧＤＦ１与内参逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ蛋白比值的灰度分析柱状图，星号表示与对照组相比的统计学显著性差异…Ｐ＜０．００１；逡逑数值以均数：ｔＳ．Ｅ．三次独立重复实验中的一次结果。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｎｋｘ２．５邋ｏｎ邋ＧＤＦ１邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｅｖｅｌ．邋（Ａ）邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋Ｎｋｘ２．５逡逑ａｎｄ邋ＧＤＦ１邋ａｆｔｅｒ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ邋Ａｄ－ｃｔｒｌ邋ａｎｄ邋Ａｄ－ｎｋｘ２．５邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋Ｈ９ｃ２邋ｃｅｌｌｓ邋ｆｏｒ邋２４ｈ．逡逑（Ｂ）邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｒａｔｉｏ邋ｏｆ邋ＧＤＦ１邋ｔｏ邋Ｐ－ａｃｔｉｎ邋，＊＊＊Ｐ＜０．００１邋ｖｓ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋Ｄａｔａ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ逡逑ｍｅａｎ士邋Ｓ．Ｅ．邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｏｎｅ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．逡逑１．５邋Ｎｋｘ２．５上调斑马鱼胚胎中Ｄｖｒｌ的表达逡逑斑马鱼作为脊椎动物模式生物和人类基因有着近８７％的高度同源性，其心血逡逑管系统的早期发育与人类极为相似［６２］，是一种研究心脏发育的良好模型。斑马逡逑鱼Ｄｖｒｌ是哺乳动物ＧＤＦ１和非洲爪蟾Ｖｇｌ的同源基因

【相似文献】