【摘要】：冠状动脉微栓塞(Coronary Microembolizaiton,CME)是来自于急性冠脉综合征易损粥样硬化斑块的自发破裂或者介入治疗挤压斑块后的血栓、斑块碎屑,其经血液脱落至冠脉微循环,常常导致冠脉微循环障碍。在急性ST段抬高心梗(ST-segment Elevation Myocardial Infarction,STEMI)急诊冠脉介入治疗中,微循环障碍常表现为无复流或者慢血流,是心血管介入医师非常棘手的问题,降低了急诊介入治疗的临床获益,是影响急性心肌梗塞患者预后的重要原因。目前针对冠脉微栓塞致心肌损伤尚无非常有效手段,包括血栓抽吸装置以及硝普钠等扩血管药物。因此,深入研究冠脉微栓塞致心肌损伤的机制就显得非常必要。近期研究表明,在心血管疾病中,自噬的活化可抑制动脉粥样斑块进展、降低急性心肌缺血、心梗、心衰所致的心肌损伤、抑制心梗后心肌重塑、抑制心肌细胞的衰老。我们前期基础研究证实在大鼠以及猪的微栓塞模型中,心肌微梗死灶在心室多处可见,梗塞中央区及边缘区可见心肌细胞早期存在凋亡、坏死、局部炎症细胞浸润以及心功能进行性下降。微栓塞后早期心肌胞存在自噬,然后进行性下降,是否促进自噬活化可以改善冠脉微栓塞后心功能,目前研究尚非常少。miRNA是非编码的小分子单链RNA,通过靶向目标m RNA,控制其转录后翻译或者促进其完全降解,广泛地参与了许多心血管疾病的调控,通过调节这些miRNA的表达,在许多心血管疾病的实验模型中,均具显著获益,包括抑制心肌梗塞后心室重塑、改善心功能。然而,miRNA是否通过调节自噬,在治疗冠脉微栓塞致心肌损伤中起重要作用,目前研究亦非常少。我们前期研究在猪以及大鼠冠脉微栓塞后心肌组织基因芯片检测发现miRNA-323-3p显著升高,通过生物信息学数据库预测Pim1是其可能的靶基因。是否miRNA-323-3p靶向Pim1调节心肌细胞自噬、凋亡,参与冠脉微栓塞至心肌损伤?我们分别从体外原代心肌细胞培养、在体大鼠冠脉微栓塞模型来研究,期待为治疗冠脉微栓塞致心肌损伤提供新的治疗手段。第一部分大鼠冠状动脉微栓塞模型中miRNA-323-3p、Pim1表达水平的动态变化目的:建立SD大鼠CME模型,观察心肌组织中miRNA-323-3p与Pim1m RNA表达的动态变化。方法:36只SD大鼠随机分为CME组(n=30)和假手术组(Sham组,n=6),CME组根据不同观察时间点随机分为0h、3h、6h、9h、12h组,每组均为6只。经左心室注射42μm微球构建CME模型,Sham组注射等量生理盐水。应用心脏超声检测心功能,ELISA检测血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平,HE染色及HBFP染色观察微梗死灶并评估微梗死面积,RT-q PCR检测miRNA-323-3p、Pim1m RNA的表达。结果:1.与Sham组比较,CME组心功能进行性下降,12h组心功能下降最显著:左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、心排血量(CO)下降;左室舒张期末径(LVIDd)、左室收缩期末径(LVIDs)升高(均P0.05)。2.与Sham组相比,CME各组cTnI均显著升高,且9h达峰值,差异有统计学意义(均P0.05)。3.与Sham组相比,CME组心肌组织HE染色可见多处微梗死灶,微血管内可见一个或者多个微栓塞球,梗塞区心肌细胞核溶解或消失,并伴有部分炎性细胞浸润;HBFP染色结果可见微梗死区心肌红染,周围正常心肌黄染。4.与Sham组相比,CME后大鼠心肌组织Pim1在3h组显著升高,然后逐渐下降(P0.05);miRNA-323-3p在3h组表达水平升高,在6h达高峰,然后逐渐下降,在12h仍显著高于Sham组。结论:CME大鼠模型成功建立,微栓塞后大鼠心功能呈进行性下降,在12h组下降最显著。大鼠心肌组织Pim1在3h组显著升高,然后逐渐下降。miRNA-323-3p在3h组表达水平升高,在6h达高峰,在12h仍显著高于Sham组。在大鼠CME3h后,miRNA-323-3p逐渐升高,而Pim1 m RNA逐渐下降,两者趋势相反,miRNA-323-3p可能抑制Pim1表达,促进心功能下降。第二部分抑制miRNA-323-3p靶向Pim1促进心肌细胞自噬、抑制心肌细胞凋亡,改善大鼠冠状动脉微栓塞后心功能目的:通过过表达或者抑制miRNA-323-3p表达,研究其对大鼠CME6h心肌细胞自噬、凋亡和心功能的影响,阐明抑制miRNA-323-3p是否靶向Pim1促进自噬、抑制凋亡,改善大鼠冠状动脉微栓塞后心功能。方法:30只SD大鼠随机分为假手术组(Sham6h组)、CME6h组、CME6h+miRNA-control(空白病毒)组,CME6h+miRNA-323-3p组、CME6h+miRNA-323-3p-inhibitor组,每组6只。CME6h+miRNA-control组,CME6h+miRNA-323-3p组、CME6h+miRNA-323-3p-inhibitor组分别经尾静脉转染装载有空白病毒、miRNA-323-3p和miRNA-323-3p-inhibitor的重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9,r AAV9),三周后,同CME6h组,一起开胸后经左心室注射含聚苯乙烯微球生理盐水建立大鼠CME模型,Sham组注射等量生理盐水。应用双荧光素酶报告基因验证Pim1是否为miRNA-323-3p的靶基因。建立微栓塞模型后6h,应用心脏超声检测心功能,ELISA检测血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平,HE染色及HBFP染色观察微梗死灶并评估微梗死面积,RT-q PCR检测miRNA-323-3p与Pim1 m RNA表达水平,Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62,凋亡相关蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3,自噬通路相关蛋白p-AMPK、AMPK、p-m TOR、m TOR、Parkin、ATG5及靶蛋白Pim1的表达水平,透射电镜观察心肌细胞自噬情况。结果:1.双荧光素酶报告基因检测结果显示,rno-miRNA-323-3p能通过结合Pim1基因3′UTR影响其荧光活性改变,差异极显著。rno-miRNA-323-3p不能通过结合突变的Pim1基因3′UTR影响其荧光活性改变,证实Pim1是rno-miRNA-323-3p靶基因。2.r AAV9感染大鼠三周后,转染效率达75%,转染成功。3.与Sham6h组比较,CME6h组miRNA-323-3p、Pim1m RNA及蛋白表达水平显著升高;与CME6h组比较,CME6h+miRNA-323-3p组miRNA-323-3p表达水平显著上调、Pim1m RNA及蛋白表达水平显著下调;与CME6h组比较,CME6h+miRNA-323-3p-inhibitor组miRNA-323-3p表达水平显著下调、Pim1m RNA及蛋白表达水平显著上调;与CME6h组比较,CME6h+miRNA-control组miRNA-323-3p、Pim1m RNA及蛋白表达水平无显著差异。4.与Sham6h组比,CME6h组cTnI水平显著升高、大鼠心功能显著降低;与CME6h组比,CME6h+miRNA-323-3p组cTnI水平显著升高、大鼠心功能显著下降,CME6h+miRNA-323-3p-inhibitor组cTnI水平显著下降、心功能显著好转,CME6h+miRNA-control组cTnI水平及心功能均无统计学差异。5.除Sham6h组外,其余各组心肌组织HE染色结果可见微栓塞球周围出现心肌微梗死灶,中央区可见心肌细胞核溶解或消失,心肌组织水肿变性并伴有部分炎性细胞浸润;HBFP染色可见微梗死灶呈局灶状,缺血梗死心肌红染,周围正常心肌黄染;CME6h组、CME6h+miRNA-control组,CME6h+miRNA-323-3p组、CME6h+miRNA-323-3p-inhibitor组微梗死面积分别为(16.25±2.81)%、(16.52±3.14)%、(21.33±4.76)%、(7.88±3.25)%;与CME6h组比,CME6h+miRNA-323-3p组心肌微梗死面积显著增加(P0.05),而CME6h+miRNA-323-3p-inhibitor组心肌微梗死面积显著减少(P0.01)。6.与sham6h组比,CME6h组心肌组织LC3Ⅱ/I、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3显著升高,p62蛋白水平降低;与CME6h组比,CME6h+miRNA-323-3p组心肌组织中LC3Ⅱ/I降低、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、p62蛋白水平显著升高;与CME6h组比,CME6h+miRNA-323-3p-inhibitor组心肌组织中LC3Ⅱ/I显著升高、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、p62蛋白相对表达水平显著下降;与CME6h组比,CME6h+miRNA-control组心肌组织中LC3Ⅱ/I、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、P62蛋白相对表达水平无统计学差异。7.与sham6h组比,CME6h组心肌组织中p-AMPK/AMPK、ATG5、Parkin蛋白相对表达水平升高,p-m TOR/m TOR蛋白相对表达水平降低;与CME6h组比,CME6h+miRNA-323-3p组心肌组织中p-AMPK/AMPK、ATG5、Parkin蛋白相对表达水平降低、p-m TOR/m TOR蛋白相对表达水平显著升高;与CME6h组比,CME6h+miRNA-323-3p-inhibitor组心肌组织中p-AMPK/AMPK、ATG5、Parkin蛋白相对表达水平显著升高、p-m TOR/m TOR蛋白相对表达水平显著下降;与CME6h组比,CME6h+miRNA-control组心肌组织中p-AMPK/AMPK、ATG5、Parkin、p-m TOR/m TOR蛋白相对表达水平无统计学差异。8.透射电镜观察Sham6h组心肌肌原纤维结构清晰,线粒体膜完整;其余四组可见心肌肌原纤维断裂,心肌细胞肌丝排列紊乱,线粒体肿胀变形;与CME6h比,CME6h+miRNA-323-3p组心肌细胞自噬数量显著减少,而CME6h+miRNA-323-3p-inhibitor组心肌组织自噬数量显著增加。结论:1.Pim1是miRNA-323-3p的靶基因之一。2.过表达miRNA-323-3p,抑制Pim1表达,抑制CME6h心肌细胞自噬,促进心肌细胞凋亡、坏死,加重心功能损伤;而抑制miRNA-323-3p表达,促进Pim1表达,促进CME6h心肌细胞自噬,抑制心肌细胞凋亡、坏死,改善心功能。3.抑制miRNA-323-3p,促进心肌细胞自噬的机制部分是通过促进Pim1过表达,活化AMPK/m TOR/ATG5自噬通路,同时激活线粒体自噬。第三部分在过氧化氢及缺氧环境中,过表达Pim1促进心肌细胞自噬、抑制心肌细胞凋亡目的:在模拟冠脉微循环障碍的过氧化氢及缺氧环境中,研究过表达Pim1对原代心肌细胞自噬与凋亡的影响及可能的自噬活化通路。方法:体外培养新生SD大鼠左室心肌细胞,分为5组(0h、3h、6h、9h、12h)。培养的原代心肌细胞置入不同浓度H_2O_2及缺氧环境中,寻找最适H_2O_2浓度与干预时间点。分别予雷帕霉素、3-Methyladenine(3-MA)干预,观察心肌细胞自噬与凋亡的变化情况。选取3h自噬高峰作为干预时间点,在100u M H_2O_2及缺氧环境中,分为对照组、Pim1过表达组,Annexin V-FITC/PI流式细胞技术检测及Caspase-3活性检测心肌细胞凋亡;m RFP-GFP-LC3双荧光标记腺病毒转染心肌细胞技术和激光共聚焦检测自噬及自噬流。透射电镜检测自噬体及自噬溶酶体、线粒体自噬。Western blotting检测Caspase-3、LC3、P62、AMPK、m TOR、ATG5、Parkin蛋白表达。结果:1.原代心肌细胞在100u M H_2O_2及缺氧环境中,3h自噬达高峰,继而下降;6h凋亡达高峰,继而下降。2.雷帕霉素促进心肌细胞自噬、抑制心肌细胞凋亡;3-MA抑制心肌细胞自噬、促进心肌细胞凋亡。3.Pim1在3h升高,继而下降,与心肌细胞自噬高峰同步。4.在100u M H_2O_2及缺氧环境中,过表达Pim1组Cleaved-Caspase-3/Caspase-3下降;自噬相关蛋白LC3II/I、p-AMPK/AMPK、ATG5、Parkin显著增加,p-m TOR/m TOR、P62显著下降。结论:在100u M H_2O_2及缺氧环境中,过表达Pim1,促进心肌细胞自噬、抑制心肌细胞凋亡,促进自噬的部分机制是通过激活AMPK/m TOR/ATG5通路,同时激活线粒体自噬。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.3
【图文】：
靶向Pim1调控的自噬与凋亡在冠状动脉微栓塞致心肌损伤中的作用及机制研究 E 组 3h、6h、9h 组心功能指标呈进行性下降（P < 0.0功能指标无显著差异（P >0.05）（表 1-4，图 1-1）表 1-4 大鼠冠脉微栓塞各组心功能指标比较（n=6, ）LVEF(%) LVFS(%) CO(L/min) LVIDd(mm) LV89.73±4.52 57.59±2.68 0.25±0.03 5.23±0.42 2.376.23±4.67a46.81±4.79a0.21±0.02a6.04±0.23a2.862.72±5.63b28.75±2.74b0.18±0.02b6.35±0.24b4.250.67±4.23c23.52±1.98c0.14±0.03c7.41±0.36c4.947.11±4.51d21.35±3.66d0.13±0.02d7.88±0.43d5.2室射血分数；CO:心排血量；LVFS:左室短轴缩短率；LVIDd:左室舒张末期内径；与 CME0h 比较，aP < 0.05；与 CME3h 组比较，bP <0.05；与 CMME9h 比较dP > 0.05。
CME后大鼠血清
图 1-3 大鼠冠脉微栓塞后心肌微梗死灶的 HE 染色（Scale bar=50μm）。A、B：假手术组（A:放大倍数 x100;B:放大倍数 x200 ),C、D：微栓塞组（C:放大倍数 x100;D:放大倍数 x200)红色箭头示微梗死灶，黑色箭头示微动脉内微栓塞球。Figure1-3HE staining of microinfarct focus in a rat CME model.A、B: sham group (A:magnification, x100,B: magnification, x100) . C、D: CME group (C:magnification, x100, D: magnification, x100). The blackarrow indicates 42-um microspheres in an arteriole, and the red arrow indicates microinfarct focus.3.5 HBFP 染色Sham 组、CME 组 3h、6h、9h 及 12h 心肌组织行 HBFP 染色(缺血梗死肌红染，正常心肌黄染)，结果 Sham 组未见微梗死灶，CME 各组均可见多微梗死区灶（图 1-4）。
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2751310
