OX-LDL诱导THP-1细胞焦亡作用及初步机制研究

发布时间：2020-07-15 07:14

【摘要】：目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)导致的冠心病严重威胁人类健康。大量研究表明:AS是一个血管内壁受损之后发生的一系列慢性炎性反应的过程,同其他炎症性疾病一样,炎性反应在AS发生、发展过程中发挥着重要作用,贯穿于AS的各个病变过程。在AS炎症中发挥重要作用的炎性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1是细胞焦亡(一种新发现的程序性死亡方式)的关键分子,我们推测AS病变过程与细胞焦亡有关。研究发现AS发生发展的重要诱因氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)会造成细胞骨架F-actin的微丝断裂、排列紊乱,甚至缺失。F-actin的结合蛋白NEXN在AS斑块中表达增高,但机制不明。本研究拟从细胞焦亡角度,用OX-LDL刺激细胞建立的细胞模型探讨NEXN在AS病理过程中发挥的作用及机制,为阐明AS病理机制提供实验依据。方法:在动脉粥样硬化形成过程中,沉积在动脉粥样硬化斑块里的细胞主要为:内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞。因此课题选用人急性单核巨噬细胞白血病细胞(THP-1)进行研究。1.OX-LDL诱导THP-1细胞发生细胞焦亡1.1 OX-LDL诱导的THP-1细胞焦亡检测用脂多糖(LPS)以及氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)分别先后诱导THP-1细胞之后,通过EB(Ethidium bromide,溴化乙锭)、EthD-2染色检测细胞pyroptosis发生率、通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞毒性以及通过聚合酶链反应(PCR)检测焦亡相关分子Caspase-1、IL-1β表达情况。蛋白免疫印迹(western blot,WB)检测活性caspase-1:Caspase-1 P10表达情况。1.2细胞焦亡抑制实验用Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK处理THP-1细胞之后通过EB、EthD-2染色检测细胞pyroptosis发生率。2.在OX-LDL诱导THP-1细胞中NEXN对细胞焦亡的作用2.1 NEXN在OX-LDL诱导THP-1细胞中细胞焦亡时的表达情况用脂多糖(LPS)以及氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)分别处理THP-1之后,检测细胞pyroptosis发生率、乳酸脱氢酶释放(LDH)、NEXN、焦亡相关分子:Caspase-1、IL-1β表达情况。2.2在OX-LDL诱导THP-1细胞中siRNA干扰NEXN后检测细胞焦亡情况为了进一步探讨在OX-LDL诱导THP-1细胞焦亡时表达增高的NEXN对细胞焦亡的作用,我们在THP-1建立的OX-LDL诱导THP-1细胞中干扰NEXN,检测细胞pyroptosis发生率、乳酸脱氢酶释放(LDH)、NEXN、焦亡相关分子:Caspase-1、IL-1β表达情况。2.3在OX-LDL诱导THP-1细胞中过表达NEXN后检测细胞焦亡情况为了进一步明确NEXN在AS中对细胞焦亡的作用,我们在OX-LDL诱导的THP-1细胞中过表达NEXN,检测细胞pyroptosis发生率、乳酸脱氢酶释放(LDH)、NEXN、焦亡相关分子:Caspase-1、IL-1β表达情况。结果:1.用40mg/ml浓度的OX-LDL诱导THP-1细胞后,OX-LDL的细胞焦亡发生率比control组高15%。2.OX-LDL诱导THP-1细胞细胞焦亡相关分子Caspase-1 mRNA转录水平是control组的2.74±0.32倍、IL-1βmRNA转录水平是control组的2.71±0.46倍,其蛋白表达水平也出现均不同程度的增高。3.OX-LDL诱导THP-1细胞中用Caspase-1抑制剂抑制细胞焦亡后,细胞焦亡发生率降低22%。4.在OX-LDL诱导THP-1细胞中细胞焦亡时,NEXN mRNA转录水平是control组的8.31±1.46倍,其蛋白表达水平也增高。5.在OX-LDL诱导THP-1细胞中siRNA干扰NEXN后,细胞焦亡发生率比siNC组升高35%,LDH比siNC组升高12.6%,IL-1β比siNC组升高28.6ng/ml,cleaved caspase-1蛋白表达量也增高。6.在OX-LDL诱导THP-1细胞中过表达NEXN后,细胞焦亡发生率比空载体组降低14%,LDH比空载体组降低29.8%,IL-1β比空载体组降低20.2ng/ml,cleaved caspase-1蛋白表达量也降低。结论:1.在OX-LDL诱导THP-1细胞中,细胞焦亡存在并发挥重要作用。2.在OX-LDL诱导THP-1细胞中,过表达NEXN,细胞焦亡减少;干扰NEXN的转录,细胞焦亡增加;说明了NEXN可能通过Caspase-1参与细胞焦亡的过程,NEXN可能对TP细胞焦亡有抑制作用。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5
【图文】：

EB及EthD-2染色细胞

EB/EthD-2染色检测（200×）：该图显示的是各组细胞EB、EthD-2染色结果

.8.3.5 抗体孵育：将 pvdf 膜用 PBST 清洗 3 遍，每次 10min，缓慢轻摇，之抗中，4℃冰箱过夜。.8.3.6 将 PVDF 膜用 PBST 清洗三遍每次 10min，缓慢轻摇，加入二抗，室温PBST 清洗 2 次，每次 10ml，缓慢轻摇。暗室中加入 ECL 发光液，显影液中显定影 2-5min。.9 统计分析 IBM SPSS Statistics 19 统计软件进行处理，实验数据采用均数±标准差统计学 P＜0.05 为有统计学意义。 OX-LDL 诱导的 THP-1 的细胞发生细胞焦亡的同时 NEXN 的基因及蛋白水平均 结果显示 OX-LDL 处理组的 caspase-1 mRNA 相对表达量是 control 组 2.74±IL-1β mRNA 相对表达量 OX-LDL 处理组是 control 组的 2.71±0.46 倍，NEXN对表达量 OX-LDL 处理组是 control 组的的 8.31±1.46 倍（P＜0.05）；western显示 OX-LDL 诱导的 THP-1 细胞的 NEXN 蛋白表达量比 control 组增高。

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 刘建民;张荣伟;袁绍纪;;颈动脉粥样硬化斑块形成原因的研究进展[J];实用医药杂志;2009年02期

2 陈玉成,梁玉佳,刘瑞,黄明慧,曾智;氧化低密度脂蛋白对血管内皮细胞骨架的损伤及其机制[J];心血管康复医学杂志;2004年04期

本文编号：2756164