ERK5易位在尼古丁促进高糖高脂诱导的H9c2细胞凋亡敏感性及纤维化机制研究

发布时间：2020-07-31 17:48

【摘要】：目的:吸烟是2型糖尿病的危险因素,也是导致心血管疾病的发生发展的重要因素。本实验通过体外研究高糖高脂条件下,尼古丁对H9c2细胞的影响模拟在吸烟人群中,糖尿病患者心肌细胞的损伤模型,进而探讨尼古丁引起高糖高脂条件下H9c2细胞的损伤机制,通过检测ERK信号蛋白明确其对心脏损伤的影响。方法:1.检测在高糖高脂条件下,尼古丁对细胞凋亡的影响。将H9c2细胞分为:正常对照组,尼古丁组(6×10~(-8)M、6×10~(-7)M、6×10~(-6)M),高糖高脂组(HGHL,葡萄糖33mmol/L+棕榈酸钠500μmol/L),尼古丁联合高糖高脂组(6×10~(-8)M+HGHL、6×10~(-7)M+HGHL、6×10~(-6)M+HGHL)。尼古丁干预2 h后,高糖高脂处理24 h,用蛋白免疫印迹方法(Western Blot)来检测相关蛋白cleaved caspase-3,cleaved caspase-8,cleaved caspase-9,cleaved caspase-11,cleaved caspase-12的表达情况,采用流式细胞术检测H9c2细胞凋亡率。2.检测尼古丁在高糖高脂条件下对细胞纤维化的影响。本部分实验分为四组:正常对照组、尼古丁组(NIC,6×10~(-7)M)、高糖高脂组(HGHL)、尼古丁联合高糖高脂组(NIC+HGHL)。用Real-Time PCR检测与H9c2细胞纤维化有关的MMP2、CollagenⅠ、CollagenⅢ、Smad3、TGF-β等基因的表达。3.检测ERK家族对H9c2细胞凋亡和纤维化的影响。1)实验分组为正常对照组、尼古丁组(NIC,1×10~(-7)M、2×10~(-7)M、4×10~(-7)M)、高糖高脂组(HGHL),尼古丁联合高糖高脂组(1×10~(-7)M NIC+HGHL、2×10~(-7)M NIC+HGHL、4×10~(-7)M NIC+HGHL)采用Western Blot技术检测ERK1/2、ERK3、ERK5的蛋白表达;2)实验分组为:正常组(CON)、尼古丁组(NIC,1×10~(-7)M)、尼古丁+ERK5抑制剂组(BIX02189+NIC),通过免疫荧光观察ERK5的核转位情况;3)实验分为:正常对照组、尼古丁组(NIC,1×10~(-7)M)、高糖高脂组、尼古丁+高糖高脂组、PD98059/BIX0218组、尼古丁+PD98059/BIX02189组、高糖高脂+PD98059/BIX02189组、尼古丁+高糖高脂+PD98059/BIX02189组。采用Western Blot技术以及PCR来探究ERK1/2抑制剂(PD98059)及ERK5抑制剂(BIX02189)对凋亡及纤维化表达的影响。结果:1.在高糖高脂条件下,尼古丁增加cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的活化及细胞凋亡率,进而促进H9c2细胞凋亡;单纯尼古丁增加与焦亡相关的cleaved caspase-11及与内质网应激凋亡相关的cleaved caspase-12的蛋白表达。与正常对照组相比,cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9在高糖高脂以及尼古丁联合高糖高脂蛋白表达显著增加(P0.01),其中,与高糖高脂组相比,6×10~(-6)M尼古丁联合高糖高脂cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达增加显著(P0.01);细胞凋亡率cleaved caspase-3蛋白表达趋势相同;而与正常对照组相比,与细胞焦亡相关的cleaved caspase-11及与内质网应激凋亡相关的cleaved caspase-12尼古丁组蛋白表达显著升高(P0.01)。2.在高糖高脂条件下,尼古丁增加MMP2、MMP8、IL-6、CollagenⅠ、CollagenⅢ、SMAD3、TGF-β及AKT等基因的表达,进而促进H9c2细胞向肌成纤维细胞转化,导致心肌细胞纤维化。与正常对照组相比,高糖高脂组及尼古丁联合高糖高脂组MMP2、MMP8以及IL-6基表达显著升高(P0.01);CollagenⅠ、CollagenⅢ、Smad3、TGF-β及AKT在尼古丁组及尼古丁联合高糖高脂组基因表达升高显著(P0.01);而MCP-1在尼古丁联合高糖高脂组基因表达显著升高(P0.01)。3.ERK5抑制剂(BIX02189)减少cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表达和与纤维化有关基因的表达。30min、1h时,pERK5在高糖高脂组、尼古丁联合高糖高脂组蛋白表达显著低于尼古丁组(P0.01),且在30min时,pERK1/2蛋白表达与pERK5的蛋白表达有相同的效应(P0.01),提示pERK1/2及pERK5参与在高糖高脂条件下,尼古丁对H9c2细胞的损伤。与高糖高脂组相比,PD98059+高糖高脂及PD98059+尼古丁+高糖高脂cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达显著增加(P0.001);而与高糖高脂组相比,BIX02189+高糖高脂组及BIX02189+尼古丁+高糖高脂组cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达显著降低(P0.001),表明ERK5抑制剂能减少H9c2细胞的凋亡。与高糖高脂组、尼古丁联合高糖高脂组相比,BIX02189能显著降低MMP2、MMP8基因的表达(P0.001)。且与尼古丁组及尼古丁联合高糖高脂组相比,BIX02189能显著降低TGF-β、AKT、CollagenⅠ及CollagenⅢ基因的表达(P0.001);同时PD98059能减少MMP2、MMP8、SMAD3基因的表达(P0.001)。结论:1.在高糖高脂条件下,尼古丁增加H9c2细胞凋亡,其中,单纯尼古丁能引起细胞焦亡及与内质网应激有关凋亡的增加。2.在高糖高脂条件下,尼古丁增加H9c2细胞与纤维化有关基因表达,进而促进H9c2细胞纤维化。3.在高糖高脂条件下,尼古丁增加ERK家族活化,其中以ERK5尤为显著,通过抑制ERK5磷酸化入核减少H9c2细胞的凋亡和纤维化。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R54
【图文】：

11图 1-1 尼古丁对 H9c2 细胞凋亡率的影响（x± s, n＝3）注：与 CON 组相比 ***P<0.001与 HGHL 组相比##P<0.001

12图 1-2 尼古丁对 H9c2 细胞凋亡率的影响（x± s, n＝3）注：与 CON 组相比 ***P<0.001与 HGHL 组相比##P<0.001

在高糖高脂条件下，尼古丁对纤维化基因表达的影响（x±s,n＝6）

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本文编号：2776799