自噬调节氧化应激条件下人脐静脉内皮细胞的功能及其机制研究

发布时间：2020-07-31 21:11

【摘要】：目的:1、研究氧化应激(Oxidative stress,OS)条件对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)内皮间质转分化(Endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)及凋亡的作用。2、观察OS条件下HUVECs中自噬及Wnt/β-catenin信号通路的变化。3、探究自噬对OS条件下的内皮功能的调节作用是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路实现。方法:1、研究OS条件对HUVECs发生EndMT及增殖凋亡的作用。分组:Control组:正常条件(21%O_2,5%CO_2,74%N_2,37°C)下培养HUVECs;OS组:正常培养条件下用H_2O_2(200μM)处理HUVECs,相应条件下培养的HUVECs于第5天进行如下实验:(1)用分光光度法检测细胞内超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量;(2)流式细胞技术检测各组细胞凋亡率;(3)光学显微镜下观察各组细胞形态学变化;(4)免疫荧光双标染色,在荧光显微镜下观察CD31、αSMA荧光强度变化及CD31~+/αSMA~+双阳性细胞(表示同时具有内皮细胞和间质细胞特性正在发生间质转分化的内皮细胞),并计数分析;(5)用Western blot法测定各组细胞中CD31、αSMA、FSP-1蛋白含量的并做比较。2、研究OS条件下HUVECs中自噬及Wnt/β-catenin信号通路的变化。实验分组:Control组:正常条件(21%O_2,5%CO_2,74%N_2,37°C)下培养HUVECs;OS组:H_2O_2(200μM)下培养HUVECs,两组细胞分别于培养5天后进行如下实验:用Western blot法测定各组细胞中Wnt/β-catenin信号通路(Wnt3a,β-catenin,survivn)和自噬(P62,LC3-II,LC3-I,Beclin-1)相关蛋白含量并比较。3、探究自噬对OS条件下的内皮功能的调节作用是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路实现。实验分组(1)OS组:H_2O_2(200μM)条件培养HUVECs;(2)H_2O_2+雷帕霉素(Rapamycin,Rap)(100nm)组:HUVECs在H_2O_2(200μM)处理3天后加入雷帕霉素共同处理2天;(3)H_2O_2+6-氨基-3-甲基嘌呤(6-Amino-3-methylpurine,3MA)(5 mm)组:HUVECs在H_2O_2(200μM)处理3天后加入3MA共同处理2天;(4)H_2O_2+BIO-acetoxime(BIO)(1μM)组:HUVECs在H_2O_2(200μM)处理3天后加入BIO共同处理2天;(5)H_2O_2+XAV939(1μM)组:HUVECs在H_2O_2(200μM)处理3天后加入XAV939共同处理2天;(6)H_2O_2+Rap+BIO组:HUVECs在H_2O_2(200μM)处理3天后加入BIO处理1天然后加入Rap共处理2天;(7)H_2O_2+Rap+XAV939组:在H_2O_2(200μM)处理3天后加入XAV939处理1天然后加入Rap共处理2天;进行如下实验:(1)流式细胞技术检测各组细胞凋亡率;(2)用Western blot法测定各组细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白(Wnt3a,β-catenin,survivn)和自噬(P62,LC3-II,LC3-I,Beclin-1)相关蛋白含量的比较。(3)免疫荧光双标染色,在荧光显微镜下观察CD31、αSMA强度变化及CD31~+/αSMA~+双阳性细胞,并计数分析。结果:1、OS条件对HUVECs的EndMT及增殖凋亡的影响(1)分光光度法检测氧化应激损伤指标SOD活性及MAD含量结果显示:与对照组比较,过氧化氢处理组SOD的活性明显增加,MAD的含量明显增加(P0.05)。(2)流式细胞技术检测各组细胞凋亡率显示:与对照组比较,过氧化氢处理模拟氧化应激条件促使细胞的凋亡率明显升高(P0.05)。(3)光学显微镜可见:与对照组比较,H_2O_2组HUVECs的形态逐渐趋向间质细胞形态,呈现两端常中间粗的纺锤形。(4)免疫双标荧光染色结果显示:与对照组比较,H_2O_2组模拟氧化应激条件促使HUVECs中可见明显的α-SMA荧光信号,且有CD31~+/αSMA~+双阳性细胞。(5)Western Blot检测显示:OS条件促进α-SMA、FSP-1蛋白表达,抑制CD31蛋白的表达(P0.05)2、OS条件下HUVECs中自噬水平及Wnt/β-catenin信号通路表达的变化(1)Western Blot检测自噬及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白结果显示:与对照组相比,H_2O_2组HUVECs中P62、Beclin-1蛋白表达下调,LC3-II/LC3-I、Wnt3a、β-catenin、survivn蛋白表达上调(P0.05)。3.调控自噬及Wnt/β-catenin信号通路对OS条件下的内皮功能的调节作用探究(1)流式细胞技术检测各组细胞凋亡率显示:与H_2O_2组比较,H_2O_2+Rap组细胞的凋亡率明显下降(P0.05),而H_2O_2+3MA组的细胞凋亡率明显升高;H_2O_2+BIO组细胞凋亡率较H_2O_2组下降,而较H_2O_2+Rap组细胞的凋亡率升高;H_2O_2+XAV939组细胞凋亡率较H_2O_2+BIO组明显升高且高于H_2O_2组;H_2O_2+Rap+XAV939组细胞的凋亡率低于H_2O_2+XAV939组而高于H_2O_2+Rap组(P0.05)。(2)Western Blot检测显示:Rap促进了OS条件诱导的自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin-1的表达,抑制了OS条件诱导的EndMT相关蛋白及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、β-catenin、α-SMA、FSP-1的表达,3MA组则表现出相反的表达趋势;与H_2O_2+Rap组比较,BIO促进了OS诱导的End MT相关蛋白α-SMA、FSP-1的表达,同时促进了OS条件诱导的Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、β-catenin、survivn的表达;Rap、Rap+BIO共同处理均抑制了OS条件诱导的EndMT相关蛋白α-SMA、FSP-1的表达,Rap组抑制作用较Rap+BIO组弱(P0.05)。(3)免疫双标荧光染色结果显示:与H_2O_2组相比,Rap、XAV939组中α-SMA强度减弱,CD31强度增强,而3MA、BIO组则趋势相反(P0.05);与BIO组相比,Rap+BIO组中α-SMA荧光强度减弱,CD31则趋势相反(P0.05)。结论:1、OS条件促进HUVECs发生EndMT及凋亡。2、OS条件激活HUVECs中Wnt/β-catenin信号通路促进自噬的发生。3、自噬通过调控Wnt/β-catenin信号通路调节OS条件下的HUVECs的功能。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5
【图文】：

提取培养原代细胞CD31的表达：免疫荧光染色，CD31（红色）、核（DAPI，蓝色）

光学显微镜下HUVECs的形态（A：100×B:200×）

图 2 光学显微镜下 HUVECs 的形态（A：100× B:200×）。3.2 用 H2O2模拟 OS 损伤我们用 H2O2(200 μM)处理 HUVECs 模拟 OS 条件，用分光光度法检测结示 H2O2(200 μM)处理的 HUVECs 中 SOD 活性明显高于对照组（P<0.05），计学意义。同时，按上述原理及方法检测各组细胞中 MDA 的含量显示，与组比较，H2O2(200 μM)处理的 HUVECs 中 MDA 含量明显升高（P<0.05）统计学意义（见图 3A,B），这提示我们用 H2O2(200 μM)处理 HUVECs 模S 条件是成功的。B

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本文编号：2777016