转录因子KLF4在香烟烟雾致肺动脉高压中的作用

发布时间：2020-08-12 14:09

【摘要】：一、香烟烟雾暴露大鼠肺小血管中转录因子KLF4的表达变化及其与肺血管重塑的关系目的:观察香烟烟雾暴露大鼠肺小血管中转录因子KLF4的表达变化,研究其与肺血管重塑的关系。方法:将20只大鼠随机分为两组:对照组(n= 9)和暴露于香烟烟雾组(n= 11)。所有的动物都在第120天取材。以HE染色及中膜厚度计算观察和评估肺血管重塑水平,以平滑肌细胞α肌动蛋白(α-SMA)染色分析肺小血管的肌化程度,以免疫荧光法测定肺血管KLF4表达水平,以肺动脉平滑肌中增殖细胞核抗原(PCNA)评估肺血管的增殖状况。结果:与健康对照组相比,熏烟组大鼠的一般状况较差,它们的肺小动脉血管壁显著增厚,肺动脉中膜厚度明显增加,肺血管总的肌化率也显著增多。与健康对照组相比,熏烟组大鼠的肺血管中未肌化的血管比例有所降低,而部分肌化及完全肌化的血管的百分比均明显升高。熏烟模型大鼠肺血管中KLF4的表达和PCNA阳性细胞数均比健康对照组显著增多。结论:KLF4在香烟烟雾导致的发生肺血管重塑的血管中表达增多。PCNA在模型组动物血管平滑肌中的表达显著增加,提示KLF4可能通过影响血管平滑肌细胞的增殖参与香烟烟雾暴露引起的肺血管重塑。二、香烟烟雾提取物致人肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移能力增强的过程中KLF4的表达变化及其发挥的作用目的:探讨在香烟烟雾提取物(CSE)作用的情况下,KLF4是否调控了人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)的增殖和迁移,以及其与AKT信号通路的关系。方法:以不同浓度的CSE干预HPASMCs48小时,用CCK-8实验观察HPASMCs的细胞活性,进而选出促进平滑肌细胞增殖的最佳浓度。以此最佳浓度的CSE按不同作用时间刺激平滑肌细胞后用Western blot法检测KLF4蛋白的表达。通过实验选出理想的KLF4-siRNA序列,然后将细胞分成4组:对照组(NC-si组)、KLF4沉默组(KLF4-si 组)、CSE 刺激组(CSE+ NC-si 组),CSE 刺激 + KLF4 沉默组(CSE+ KLF4-si组)。通过细胞计数和细胞活力检测及PCNA蛋白的表达测定观察比较细胞的增殖情况,通过Transwell迁移实验比较细胞的迁移能力。通过检测AKT和磷酸化AKT的蛋白水平的表达变化,探讨KLF4是否通过此信号通路影响了肺动脉平滑肌细胞的增殖、迁移。结果:2%CSE持续作用48小时对HPASMCs的促增殖作用最强,于此同时在2%CSE刺激下KLF4的蛋白表达水平升高。在2%CSE刺激的条件下,HPASMCs的细胞数量增多,PCNA的表达水平、细胞活力及细胞迁移能力也明显增强,而KLF4-siRNA可以明显抑制因CSE引起的上述改变。另外,CSE诱导引起的AKT磷酸化水平的上升在KLF4沉默组细胞中也得到了显著的抑制。结论:KLF4可能通过作用于AKT信号通路促进了 CSE介导的HPASMCs的增殖与迁移。三、经气道注入AAV1-KLF4-shRNA构建肺血管基因敲减模型,并观察其在香烟烟雾所致肺动脉高压中的预防作用目的:在香烟烟雾暴露致大鼠肺动脉高压模型中观察经气道注入1型腺相关病毒(AAV1)携带的KLF4-shRNA是否对肺血管有持续的KLF4基因敲减作用,并观察这种选择性的基因敲减是否能预防肺动脉高压的发生发展。方法:动物随机分为健康对照组、预防干预组(AAV1-KLF4-shRNA)、对照病毒模型组(AAV1-controlvector)和生理盐水模型组。后三组大鼠气管内给药30天后,接受香烟烟雾刺激4个月。我们用右心导管进行血流动力学测量,计算右心室肥厚指数,观察肺血管重塑和肌化程度,并通过免疫组化染色比较各组大鼠肺动脉中KLF4和PCNA的表达变化。结果:在两组肺动脉高压模型组(生理盐水模型组和对照病毒模型组),部分血流动力学指标(右心室收缩压、右心室平均压、右心室收缩指数、dp/dt max等)、反映肺血管和右心室重塑的指标(肺小动脉中膜厚度、右心室肥厚指数和右室重/体重等)、肺血管肌化率、肺动脉中KLF4和PCNA的表达均比健康对照组显著升高。而在预防干预组,上述指标均比两组模型组显著减少。结论:通过1型腺相关病毒(AAV1)携带的KLF4-shRNA靶向血管敲减KLF4基因可以有效预防肺动脉高压的发展。四、经气道注入AAV1-KLF4-shRNA在香烟烟雾所致肺动脉高压中的治疗作用目的:探讨经气道注入1型腺相关病毒(AAV1)携带的KLF4-shRNA是否对肺动脉高压有治疗效果。方法:先将大鼠随机分为两组:健康对照组和吸烟组。吸烟组每日2次暴露于香烟烟雾,对照组暴露于空气中。3个月后,将吸烟组大鼠再随机分为3组:气管内注入AAV1携带的KLF4shRNA(治疗组)、AAV1携带的对照载体(AAVl-controlvector)组、生理盐水组。继续按原方案熏烟1个月后,对4组大鼠进行血流动力学测量,并计算右心室肥厚指数,观察肺血管重塑和肌化程度。通过免疫组化染色测定肺动脉KLF4和PCNA水平。结果:在两组肺动脉高压模型组(生理盐水模型组和对照病毒模型组),部分血流动力学指标(右心室收缩压、右心室平均压、右心室收缩指数、dp/dtmax等)、反映肺血管和右心室重塑的指标(肺小动脉中膜厚度、右心室肥厚指数和右室重/体重等)、肺血管肌化率、肺动脉中KLF4和PCNA的表达均比健康对照组显著升高。而在治疗干预组,上述指标均比两组模型组显著减少。结论:转录因子KLF4的上调在与肺动脉高压相关的血管及右心室的病理改变中起了重要作用,选择性肺血管KLF4基因敲减可以作为肺动脉高压的治疗的新手段。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R544.1
【图文】：

血管,大鼠,小动脉,程度

图 1 肺血管重塑的观察比较肺血管 HE 染色图像 A 健康对照组（Control）B 吸烟组（Smoke），标尺：50μm；C：两组大鼠肺小动脉血管的中膜厚度比较，n= 8，*P < 0.05。3.3 大鼠肺血管肌化程度比较如图 2 所示，吸烟组大鼠的肺血管肌化程度明显高于健康对照组。其中，对照组大鼠肺血管总的肌化率为 14 3%，而吸烟组大鼠肺血管总的肌化率为 49 6%（P <0.001）；另外，与健康对照组相比，吸烟组大鼠的肺血管中未肌化的血管比例有所降低（P < 0.001），而部分肌化及完全肌化的血管的百分比均明显升高（部分肌化 P <0.01；完全肌化 P < 0.001）（图 2）。3.4 模型组大鼠肺血管中 KLF4 表达升高免疫荧光实验显示，吸烟组大鼠肺血管中 KLF4 的表达明显强于健康对照组（图

血管,免疫组化,标尺,图像

图 2 大鼠肺血管肌化程度比较 A 健康对照组（Control）和 B 吸烟组（Smoke）的 α-SMA 免疫组化的代表图像，标尺：100μm；C 和 D 是上述两组的局部肺小血管的放大图像；E 为两组大鼠肺小血管总肌化率的比较，F 比较两组大鼠肺小血管中未肌化血管（NM）、部分肌化血管（PM）和完全肌化血管（M）占所有肺小血管的百分比 n= 8，**P < 0.01，***P < 0.001。

血管,红色荧光,免疫荧光,标尺

吸烟组大鼠肺血管中 KLF4 的表达明显强于健康对照组（图3A）。经测算两组肺血管中阳性区域的平均积分光密度(IOD)，吸烟组明显高于健康对照组，约为对照组的 4 倍（P < 0.05）（图 3B）。3.5 模型组大鼠肺血管平滑肌中 PCNA 阳性细胞数增多关于增殖细胞核抗原（PCNA）的免疫组化实验显示，模型组大鼠肺血管中 PCNA阳性平滑肌细胞数显著增多（图 4A-B）。计算各组 PCNA 阳性细胞核与总细胞核的比

【参考文献】