MiR-96-5p靶向VAMP8抑制血小板活化的研究

发布时间：2020-08-25 21:35

【摘要】：目的:探讨miR-96-5p在血小板中对VAMP8的调控作用及对血小板活化的影响。方法:(1)通过体外培养具有双向分化潜能的人成巨核细胞白血病细胞Meg-01,采用佛波脂(phorbol-12-mystrate-13-acetate,PMA)诱导其分化成成熟的巨核细胞,进而产生类血小板。(2)通过向分化而成的巨核细胞/血小板内转染miR-96-5p的模拟物(Mimic)及抑制物(Inhibitor),本实验共设置五个组:Control组,miR-96-5p Mimic组,Mimic Control组,miR-96-5p Inhibitor组,Inhibitor Control组。用q-RT-PCR检测各组中miR-96的表达水平、VAMP8 mRNA的表达水平;用Western Blot检测各组VAMP8、PAC-1、CD62P蛋白表达水平。(3)利用靶基因预测网址TargetScan预测VAMP8基因与miR-96-5p是否有结合位点,并用双荧光素酶报告基因验证VAMP8是否是miR-96-5p的靶基因。结果:(1)Meg-01细胞经PMA诱导72小时后,细胞形态向成熟巨核细胞形态变化,且血小板表面标记物CD61的表达增加,证实Meg-01细胞经PMA诱导成功分化产生类血小板。(2)向巨核细胞/血小板转染miR-96-5p的模拟物及抑制物后,q-RT-PCR检测miR-96的表达,miR-96-5p Mimic组的miR-96的表达明显高于Control组和Mimic Control组(P0.05);miR-96-5p Inhibitor组的miR-96的表达明显低于Control组和Inhibitor Control组(P0.05)。q-RT-PCR检测VAMP8 mRNA的表达:miR-96-5p Mimic组对比Control组和Mimic Control组无明显差异(P0.05);miR-96-5p Inhibitor组对比Control组和Inhibitor Control组无明显差异(P0.05)。WB检测miR-96-5p Mimic组的VAMP8、PAC-1、CD62p的蛋白表达明显低于Control组和Mimic Control组(P0.05);miR-96-5p Inhibitor组的VAMP8、PAC-1、CD62p的蛋白表达明显高于Control组和Inhibitor Control组(P0.05)。(3)靶基因预测网站TargetScan预测发现miR-96-5p与VAMP8 3’UTR区的58-64碱基序列有结合位点。双荧光素酶报告基因实验显示,共转染了miR-96-5p Mimic和VAMP8 3’UTR WT载体组较共转染了Mimic Control和VAMP8 3’UTR WT载体组荧光强度下降(P0.05);而共转染了miR-96-5p Mimic和VAMP8 3’UTR MUT载体组较共转染了Mimic Control和VAMP8 3’UTR MUT载体组荧光强度无明显差异,表明miR-96-5p是通过与VAMP8 3’UTR的该结合位点靶向结合影响荧光素酶的活性,证实VAMP8是miR-96-5p的靶基因。结论:(1)miR-96-5p可以在血小板中靶向抑制VAMP8蛋白表达从而抑制血小板活化,miR-96-5p可能成为预测血小板活化状态的指标。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：

第 3 章 结果第 3 章 结果3.1 Meg-01 细胞经 PMA 诱导分化成巨核细胞/血小板Meg-01 细胞为人成巨核细胞白血病细胞，正常的 Meg-01 细胞为圆形的单个悬浮细胞（如图 3.1.1）。经 PMA 诱导 72 小时后，细胞形态发生变化，体积增大，细胞呈梭形变化，伸出伪足，细胞核不甚清晰，细胞空泡生成，细胞贴壁增多（如图 3.1.2）。收集诱导前后的细胞，用流式细胞术检测细胞表面 CD61的表达，如图 3.1.3，诱导后细胞表面 CD61 的表达显著增加。进一步提取 RNA检测 CD61 mRNA 的表达，如图 3.1.4，诱导后细胞 CD61 mRNA 的表达显著增加。上述结果表明 Meg-01 细胞经 PMA 诱导 72 小时后成功分化成血小板。

第 3 章 结果第 3 章 结果3.1 Meg-01 细胞经 PMA 诱导分化成巨核细胞/血小板Meg-01 细胞为人成巨核细胞白血病细胞，正常的 Meg-01 细胞为圆形的单个悬浮细胞（如图 3.1.1）。经 PMA 诱导 72 小时后，细胞形态发生变化，体积增大，细胞呈梭形变化，伸出伪足，细胞核不甚清晰，细胞空泡生成，细胞贴壁增多（如图 3.1.2）。收集诱导前后的细胞，用流式细胞术检测细胞表面 CD61的表达，如图 3.1.3，诱导后细胞表面 CD61 的表达显著增加。进一步提取 RNA检测 CD61 mRNA 的表达，如图 3.1.4，诱导后细胞 CD61 mRNA 的表达显著增加。上述结果表明 Meg-01 细胞经 PMA 诱导 72 小时后成功分化成血小板。

细胞呈梭形变化，伸出伪足，细胞核不甚清晰，细胞空泡生成，细胞贴壁增多（如图 3.1.2）。收集诱导前后的细胞，用流式细胞术检测细胞表面 CD61的表达，如图 3.1.3，诱导后细胞表面 CD61 的表达显著增加。进一步提取 RNA检测 CD61 mRNA 的表达，如图 3.1.4，诱导后细胞 CD61 mRNA 的表达显著增加。上述结果表明 Meg-01 细胞经 PMA 诱导 72 小时后成功分化成血小板。图 3.1.1-3.1.2 Meg-01 细胞经 PMA 诱导 72h 分化成巨核细胞/血小板

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本文编号：2804233