miR-499a-3p对原代HUVEC功能的影响及分子机制的研究

发布时间：2020-08-28 22:06

　　研究背景在临床诊疗中,不稳定型心绞痛的病情变化十分不稳定,在负荷时、休息时均可发作。冠状动脉粥样硬化斑块破裂和血栓形成是导致不稳定型心绞痛的原因,它们的发生均与内皮细胞的功能紊乱相关。目前,不稳定型心绞痛缺乏快速、特异、有效的检测指标,使早期诊断难以准确,只能靠传统指标做出临床疑似诊断。因此,如何快速诊断不稳定型心绞痛仍有研究意义。在研究的前期,我们通过RT-PCR技术检测到,与疑似不稳定型心绞痛的非冠心病患者相比,不稳定型心绞痛患者的血清中miR-499a-3p的表达量明显增高,然后,通过Target scan预测ADAM10为miR-499a-3p的下游靶基因。同时,使用荧光素酶报告基因技术检测,发现miR-499a-3p与ADAM10存在负性的靶向调控关系。研究目的:(1)在前期研究基础上,探讨miR-499a-3p对原代HUVEC功能的影响;(2)验证miR-499a-3p是否参与原代HUVEC调控ADAM10的表达。研究方法:使用原代HUVEC代替人冠状动脉血管内皮细胞,将原代HUVEC按转染慢病毒类型分为四组,即未转染病毒的原代HUVEC为空白组(NC组)、转染CO137阴性病毒的原代HUVEC为miR-NC组(空载组)、转染miR-499a的原代HUVEC为miR-499a-3p mimics组(上调组)及转染miR-499a-3p inhibitors的原代HUVEC为miR-499a-3p inhibitors组(下调组)。构建携带慢病毒miR-499a-3p高表达或低表达的原代HUVEC稳定转染株。然后,使用实时荧光定量PCR技术检测四组原代HUVEC中miR-499a-3p及ADAM10的表达量。运用蛋白质印迹实验检测四组原代HUVEC中ADAM10的表达量。然后,运用划痕实验、Transwell实验、CCK8实验明确空白组、miR-NC组、miR-499a-3p mimics组和miR-499a-3p inhibitors组中稳定转染的原代HUVEC的增殖、迁移能力变化。运用流式细胞术明确空白组、miR-NC组、miR-499a-3p mimics组和miR-499a-3p inhibitors组中原代HUVEC凋亡情况。研究结果:(1)慢病毒转染预实验结果:转染慢病毒至原代HUVEC的最适合的MOI为10及转染最适合的条件为慢病毒+内皮细胞完全培养基;(2)稳定转染细胞株的筛选结果显示:嘌呤霉素溶液筛选稳定转染细胞的最合适浓度为2μg/mL。(3)RT-PCR实验结果:空白组与miR-NC组的HUVEC中miR-499a-3p及ADAM10的表达量无显著差异(P㧐0.05)。与空白组和miR-NC组相比,miR-499a-3p mimics组细胞中miR-499a-3p的表达量明显升高(P0.01),ADAM10明显降低(P0.05)。在miR-499a-3p inhibitors组细胞中miR-499a-3p的表达量明显降低(P0.05),ADAM10明显升高(P0.05)。(4)蛋白免疫印迹试验结果:与空白组和miR-NC组相比,miR-499a-3p mimics组细胞中ADAM10蛋白表达明显降低(P0.05);miR-499a-3p inhibitors组细胞中ADAM10蛋白明显升高(P0.05)。(5)细胞划痕实验、Transwell实验、细胞增殖实验结果:与空白组和miR-NC组相比,原代HUVEC稳定转染miR-499a-3p mimics后,迁移细胞数量减少,迁移能力受到显著抑制(P0.05);而稳转miR-499a-3p inhibitors后,迁移细胞数量增加,迁移能力受到显著增强(P0.05)。(6)流式细胞术检测细胞凋亡实验结果:与空白组和miR-NC组相比,miR-499a-3p mimics组凋亡细胞总数明显增高(P0.05)。miR-499a-3p inhibitors组凋亡细胞总数明显减少(P0.05)。表明:miR-499a-3p能诱导原代HUVEC的凋亡。研究结论:(1)慢病毒稳定转染细胞株构建成功。(2)在四组实验细胞中,miR-499a-3p表达上调会抑制ADAM10的表达miR-499a-3p抑制原代HUVEC的增殖、迁移能力,诱导细胞凋亡。其机制可能与ADAM10蛋白的表达相关。内皮细胞功能紊乱与AS和血栓形成的发生发展密切相关,AS的破裂和血栓形成是导致不稳定型心绞痛的原因。故在前期研究结果的基础上,根据本实验的研究结果推测,miR-499a-3p与ADAM10之间的作用参与UA的发生发展。检测miR-499a-3p的表达有望成为UA新的早期诊断生物标记物,为避免恶性冠脉事件的发生提供了潜在的干预靶点。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R541.4
【部分图文】：

流式细胞技术,检测结果,百分比

47注：图 A 为流式细胞技术检测细胞凋亡的情况图，图片 B 为流式细胞技术检测后，各组凋亡细胞的占总细胞的百分比的统计值图。两图片中 NC、miR-NC、miR-499a-3p mimics、miR-499a-3p inhibitors所代表组与其他图相同。图 B 中显示,与 NC 组比较，miR-499a-3p mimics 中，凋亡的细胞百分比增高（*P＜0.05）； miR-499a-3p inhibitors 中，凋亡的细胞百分比降低（*P＜0.05）。图 3-10 流式细胞技术检测结果Note. FigureAis a graph of cell apoptosis detected by flow cytometry, and panel B is a graph of thepercentage of total cells in each group of apoptotic cells after flow cytometry. The groups represented by

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