抗CD19和CD22嵌合抗原受体T细胞的构建及在B系肿瘤中的联合应用

发布时间：2020-09-03 12:13

　　 【目的】虽然急性B淋巴细胞白血病和B细胞恶性淋巴瘤的治疗效果取得了很大提高,但是仍然有一部分患者是复发难治的。靶向CD19嵌合抗原受体(CAR19)T细胞疗法引起了前所未有的治疗效果。然而,CD19阴性复发是CAR-T治疗失败的最常见原因,并且缺乏有效的治疗手段,因此需要我们寻找新的治疗方法。我们分别构建了靶向CD19和CD22的第三代CAR慢病毒载体,在体内外验证了有效性和安全性。在本中心,我们进行了一项开放标签,单中心和单臂临床试验研究,以探索联合序贯输注抗CD19和CD22 CART治疗r/r B-ALL/NHL患者的疗效和安全性。【方法】构建靶向CD19和CD22 CAR的慢病毒载体,共转染到293T细胞中包装慢病毒。磁珠分选供者的CD3+T细胞后进行慢病毒转导,在体外大量扩增并检测病毒转染效率和凋亡比例。另外进行体外杀瘤实验,细胞因子分泌,CD107a表达等实验,来验证CD19和CD22 CART细胞的体外功能;在NSG异种移植小鼠模型中验证CD19和CD22 CART细胞在体内的杀伤肿瘤效应。89例难治复发的B-ALL/B-NHL患者入组参加本中心联合序贯输注抗CD19和CD22CART治疗的临床试验。统计分析患者的诊疗经过,以系统评估二者联合应用的安全性和有效性。对患者的遗传学因素和其他临床参数进行分析,探索其对CAR-T细胞疗法的预后价值。【结果】成功构建了第三代抗CD19 CAR和CD22 CAR,稳定高效地在T细胞上表达,凋亡水平无明显增加。检测体外杀瘤效应,细胞因子分泌以及CD107a表达,都显示了CAR-T细胞良好的功能。抗CD19 CAR-T和CD22 CAR-T细胞在体内也展现了良好的杀伤肿瘤效应,而且不引起治疗相关毒性反应。在体外功能方面,CD19 CAR-T和CD22CAR-T细胞之间均无明显差异。51例B-ALL的队列中,MRD阴性反应率为96.0%(95%置信区间(CI),86.3至99.5)。中位随访时间为7.6个月,中位PFS为12.0个月(95%CI,5.4至18.6),未达到中位OS(NR)(95%CI,10.1至NR)。38例B-NHL的队列中,总有效率为72.2%(95%CI,54.8~85.8),完全缓解率为50.0%(95%CI,32.9~67.1)。中位随访时间为5.3个月,中位PFS为5.8个月(95%CI,3.3至NR),中位OS为NR(95%CI,6.1至NR)。CAR19/22 T细胞治疗后未检测到CD19或CD22的丢失。重度CRS和CRES发生率分别为22.4%和13.5%。除一例外,均可逆转。【结论】第三代抗CD19 CAR-T和CD22 CAR-T细胞,在体内外是安全,有效和特异的。联合序贯输注CAR19/CAR22 T细胞治疗B细胞恶性肿瘤是有效且安全的,并且可以克服CD19/CD22靶向治疗中的抗原丢失复发问题。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R730.51;R733
【部分图文】：

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文结果1、 构建抗 CD19 和 CD22 PLVX-EF1a-CAR 慢病毒质粒CAR 由胞外域、跨膜域和胞内区三个部分组成.利用基因合成的方法，将信号肽，鼠源 anti-CD19 和 anti-CD22 的 scfv 分别与 CD8 铰链区，CD28 跨膜域，共刺激分子CD28 和 CD137,激活信号 CD3-zeta 按顺序串联起来，并构建到 PLVX 慢病毒载体中（图 1A,1B）。经一代测序后，序列比对完全正确，最终获得了成功构建的 anti-CD19和 anti-CD22 CAR 慢病毒质粒。

图 2. CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T 转效及凋亡以上结果表明，成功包装的抗 CD19 CAR 和 CD22 CAR 慢病毒，能够在健患者来源的 CD3+T 细胞上表达，可以获得高效稳定的病毒转染效率，并且及培养后 CAR-T 细胞凋亡水平无明显增加。 CART 细胞体外杀瘤实验效应测定Raji 细胞是 B 系淋巴瘤细胞系，表达 CD19 和 CD22 抗原，而 K562 细胞是血病细胞，不表达表达 CD19 和 CD22 抗原。CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T特异性地杀伤 Raji 细胞，而对 K562 细胞无明显杀瘤作用。以 50:1, 10:1, 2:1靶比例，未转染对照 T 细胞，CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T 细胞分别与 R K562 细胞共培养 24 小时后，运用钙黄绿素-AM 释放法检测 CAR-T 细胞体应。杀瘤结果显示，四种效靶比下，未转染 T 细胞（control T）对 Raji 细胞

1.52%±0.57%； CD19 CAR-T 对 Raji 细胞的杀瘤效率分别为 92.47%±6.29%、64.56%±4.25%、31.37%±2.58 %、14.39%±2.81%，对 K562 细胞的杀瘤效率分别为11.75%±4.12%、 6.42%±3.23%、 3.37%±1.44%、1.81%±0.35%；CD22 CAR-T 对Raji 细胞的杀瘤效率分别为 95.23%±4.39% 、 73.05%±4.18% 、 34.22%±3.43% 、13.66%±1.15%，对 K562 细胞的杀瘤效率分别为 14.20%±6.49%、8.72%±3.22%、3.06%±1.44%、1.21%±0.43%（图 3A,3B）。比较四个比例下，CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T 细胞对 Raji 细胞或 K562 细胞的杀瘤效率，统计学分析后发现 CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T 细胞两者之间差异无统计学意义（p>0.05）。以上结果表明，CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T 细胞对 CD19 或 CD22 阳性靶细胞具有很好的杀伤效果，即使是在低效靶比的情况下，依然能够显示出相当好的杀瘤效应。并且都显示了良好的杀伤特异性，几乎不对 CD19 或 CD22 阴性靶细胞产生杀伤效应。另外，两者在体外的肿瘤杀伤能力相近，有利于后续比较二者在体内的功能。

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本文编号：2811411