自噬在曲美他嗪保护心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制

发布时间：2020-09-07 21:19

　　 第一部分曲美他嗪减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤及抑制自噬的研究目的:探讨曲美他嗪(Trimetazidine,TMZ)在大鼠心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)中对心肌细胞自噬的影响。方法:使用Sprague-Dawley(SD)大鼠建立MI/RI模型,选取时间点为缺血30 min、再灌注2 h。大鼠分为4组:假手术(Sham)组、缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)组、曲美他嗪(TMZ)组、I/R+TMZ组。模型建立结束后给予大鼠心脏超声检查,再经腹主动脉采血,然后留取结扎线横断面以下的心脏组织,以备进一步检测。血清ELISA法测量心肌损伤状况、氧化应激程度,TTC染色评估心肌梗死面积,TUNEL染色了解心肌细胞凋亡率,透射电镜观察心肌超微结构、自噬小体,免疫组化检测LC3B及Beclin1,RT-PCR测定LC3、Beclin1、P62、ATG5和ATG7 mRNA的表达,Western Blot检查LC3-I/II、Beclin1、P62、ATG5、ATG7蛋白的表达以及AKT、mTOR总蛋白及其磷酸化蛋白的表达。结果:(1)心脏超声:I/R组及I/R+TMZ组心率低于Sham组及TMZ组,但四组差异无统计学意义(P0.05)。与Sham组EF、FS(分别是83.975±1.483%、47.475±1.644%)相比,I/R组EF、FS(分别是60.063±3.448%、27.800±2.194%)明显降低(P0.01),TMZ治疗后明显提高(分别是68.925±2.910%、33.850±2.220%,P0.01)。同时,I/R组ESV(0.219±0.036 ml)、EDV(0.545±0.053 ml)明显大于Sham组ESV、EDV(分别是0.070±0.009 ml、0.439±0.026 ml,P0.01),给予TMZ干预后明显降低(分别是0.146±0.028 ml、0.471±0.071 ml,P0.01)。I/R组LVIDs、LVIDd(分别是0.445±0.028cm、0.616±0.022 cm)明显高于Sham组(分别是0.300±0.013 cm和0.571±0.012 cm,P0.01),TMZ治疗后分别降至(0.386±0.024 cm,P0.01)和(0.584±0.032 cm,P0.05)。此外,Sham组与TMZ组的上述心脏功能指数无显著性差异(P0.05)。(2)血清生化:I/R组血清LDH、CK-MB、ROS和MDA水平显著高于Sham组(P0.01),TMZ治疗后明显降低(P0.01)。I/R组SOD、GSH-px水平明显低于Sham组(P0.01),TMZ干预后二者水平显著增加(P0.01)。同时,与Sham组相比,TMZ组对上述指标无显著性影响(P0.05)。(3)HE染色:Sham组的心肌细胞整齐分布,胞核位于肌纤维的中央;I/R组可观察到明显的变化如心肌结构严重变形、间质水肿、心肌细胞坏死和核溶解等;I/R+TMZ组可见心肌正常结构大部分保存,间质水肿、心肌细胞坏死较I/R组减少。(4)TTC染色:Sham组及TMZ组未见心肌梗死,I/R组心肌梗死面积明显增加,TMZ+I/R组较I/R组显著减少(P0.01)。(5)TUNEL染色:I/R组心肌细胞阳性的数量明显大于Sham组(P0.01),TMZ干预后减少(P0.01)。(6)透射电镜:与Sham相比,I/R组自噬小体数量有所增加,线粒体超微结构发生变化如肿胀、崩解以及嵴减少甚至消失;TMZ处理后自噬小体减少且线粒体形态有所改善。(7)免疫组织化学染色:与Sham组相比,I/R组Beclin1、LC3B蛋白水平明显增加(P0.01),TMZ处理后明显降低(P0.01)。(8)Western Blot与RT-PCR:Western Blot表现出I/R组LC3-II、Beclin1、ATG5和ATG7蛋白的表达较Sham组明显增多(P0.01),TMZ处理后显著减少(P0.01);I/R组P62蛋白的表达较Sham组明显降低(P0.01),TMZ处理后有所增加(P0.01)。RT-PCR显示LC3、Beclin1、ATG5和ATG7 mRNA表达的趋势与其蛋白水平一致,而P62 mRNA水平无显著变化。与Sham组相比,I/R组p-AKT~(Ser473)和p-mTOR~(Ser2448)的表达明显增多(P0.01),TMZ处理后显著减少(P0.01)。结论:TMZ可改善MI/R大鼠心脏功能,减轻氧化应激,减少心肌梗死及心肌细胞凋亡,改善心肌组织结构。TMZ可抑制MI/RI诱导的过度自噬,可能是通过激活AKT/mTOR通路发挥作用。第二部分自噬在曲美他嗪保护H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤中作用及机制研究目的:探讨自噬在曲美他嗪保护H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤中作用及机制。方法:使用大鼠H9c2心肌细胞模拟体内I/R模型建立缺氧复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型。首先,给予0、1、2、3、4、6、8 h缺氧时间梯度处理细胞,检测LC3-I/II和Beclin1蛋白的表达,筛选缺氧时间;再给予0、1、2、3、4、6 h复氧时间梯度处理细胞,检测LC3-I/II和Beclin1的表达,筛选复氧时间;然后再按确定的缺氧、复氧时间实施后续实验。按照处理因素不同,分为空白对照(Control)组、Control+TMZ组、Control+LY294002(PI3K抑制剂)组、H/R组、H/R+TMZ组、H/R+LY294002组、H/R+TMZ+LY294002组。使用CCK-8试剂盒测定细胞存活率,微板法测定LDH、SOD水平,流式细胞仪测量细胞凋亡率,透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察细胞超微结构、自噬小体数量,激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察细胞自噬荧光情况,Western Blot检查LC3-I/II、Beclin1、P62、ATG5、ATG7、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白的表达以及AKT、m TOR总蛋白及其磷酸化的水平。结果:(1)筛选缺氧复氧时间:H9c2心肌细胞分别缺氧0、1、2、3、4、6、8 h,LC3-II和Beclin1蛋白水平在缺氧2 h达到峰值后逐渐降低;选择缺氧2 h用于后续实验。H9c2心肌细胞缺氧2 h后分别复氧0、1、2、3、4、6 h,LC3-II和Beclin1蛋白水平随时间增加而增加,且复氧4 h达到峰值后下降;选择复氧4 h用于后续研究。根据筛选及实验所需,后续细胞分组实验的缺氧、复氧时间分别是2 h、4 h。(2)CCK-8实验:H/R组的细胞存活率明显小于Control组(P0.01),TMZ预处理后显著升高(P0.01),该作用却被LY294002明显消除(P0.01)。(3)微板法测定:H/R组细胞培养液中LDH水平较Control组增高(P0.01),TMZ处理后明显下降(P0.01),但LY294002可以明显抑制这种效应(P0.01);H/R组细胞内SOD水平显著低于Control组(P0.01),TMZ处理后明显上升(P0.01),LY294002可明显逆转这种效应(P0.01)。(4)流式细胞仪测定:H/R组细胞凋亡率明显大于Control组(P0.01),给予TMZ干预后却明显减少(P0.01),该作用被LY294002消除(P0.01)。(5)TEM检测:大多数自噬小体具有双层膜结构,被细胞质中的线粒体或其他细胞器包围;Control组、Control+TMZ组和Control+LY294002组自噬小体的数量一致,无显著性差异(P0.05);H/R组自噬小体的数量明显大于Control组(P0.01),TMZ干预后显著降低(P0.01),但此作用却被LY294002明显消除(P0.01)。(6)CLSM观察:H/R组细胞自噬荧光明显累积,TMZ干预后自噬荧光明显减少,TMZ与LY294002共处理后自噬荧光增多。(7)Western Blot检测:H/R组的LC3-II、Beclin1、ATG5、ATG7蛋白的表达水平明显高于Control组(P0.01);H/R+TMZ组的这些蛋白水平较H/R组明显降低(P0.01),而LY294002可抑制TMZ的该作用(P0.01);但是,H/R组P62蛋白表达明显低于Control组(P0.01),TMZ处理后明显升高(P0.01),此作用被LY294002抑制(P0.01);Control组和Control+TMZ组的LC3-II、Beclin1、P62、ATG5和ATG7蛋白表达水平无显著性差异(P0.05);另外,H/R组、H/R+LY294002组和H/R+TMZ+LY294002组的这些蛋白表达亦无显著性差异(P0.05)。同时,TMZ预处理可降低Cleaved caspase-3和Bax蛋白水平,增加Bcl-2蛋白水平,提高Bcl-2/Bax比值(P0.01),此作用被LY294002抑制(P0.01)。H/R组p-AKTSer473和p-mTOR~(Ser2448)蛋白的表达较Control组明显降低(P0.01);与H/R组相比,H/R+TMZ组p-AKTSer473和p-mTOR~(Ser2448)蛋白表达水平明显增加(P0.01),LY294002可明显减弱TMZ的此种作用(P0.01)。结论:TMZ可能通过激活AKT/m TOR通路抑制H/R诱导的H9c2心肌细胞自噬,减轻细胞损伤及凋亡,增加细胞存活。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R54
【部分图文】：

重庆医科大学博士研究生学位论文表 1.1 TMZ 对 MI/R 术后大鼠心脏功能的影响 ( x±s)Table1.1 Effect of TMZ on cardiac function in rats after MI/R ( x±s)Sham I/R TMZ I/R+TMZHR(bmp) 429.833±28.202 400.200±22.388&429.167±26.806 410.400±37.799&EF(%) 83.975±1.483 60.06±3.448**83.725±0.994 68.925±2.910##FS(%) 47.475±1.644 27.800±2.194**47.250±1.108 33.850±2.220##ESV(ml) 0.070 ± 0.009 0.219±0.036**0.067±0.017 0.146 ± 0.028##EDV(ml) 0.439 ± 0.026 0.545 ± 0.053**0.408±0.058 0.471±0.071##LVIDs(cm) 0.300 ± 0.013 0.445 ± 0.028**0.294±0.027 0.386 ± 0.024##LVIDd(cm) 0.571 ± 0.012 0.616 ± 0.022**0.556±0.030 0.584 ± 0.032#n = 8;**P < 0.01, vs Sham group;#P < 0.05, vs I/R group;##P < 0.01, vs I/R group; and&P>0.05, vs Sham or I/R group

后降低（P < 0.01）（表 1.2，图 1.2A-D）。I/R 组 SOD、GSH-px 水平明显低于 Sham组（P < 0.01），TMZ 干预后二者水平显著增加（P < 0.01）（表 1.2，图 1.2E-F）。同时，与 Sham 组相比，TMZ 组对上述指标无显著性影响（P > 0.05）。这些结果表明 TMZ 可以减轻 MI/R 诱导的大鼠心肌损伤和氧化应激。表 1.2 TMZ 对 MI/R 术后大鼠心肌损伤及氧化应激的影响 ( x±s)Table 1.2 Influence of TMZ on myocardial injury and oxidative stress in rats after MI/R ( x±s)Sham I/R TMZ I/R+TMZCK-MB(ng/ml) 7.20±0.83 18.51±4.05**7.32±0.89 9.83±1.88##LDH(ng/ml) 36.63±3.67 90.81±14.03**36.68±2.21 58.66±5.39##ROS(pg/ml) 862.51±72.79 1369.23±62.29**893.93±69.39 1060.66±59.42##MDA(ng/ml) 125.29±11.02 182.49±5.28**127.94±11.51 150.37±5.57##SOD(pg/ml) 1379.24±102.63 772.12±51.33**1360.03±97.57 1022.58±84.91##GSH-px(ng/ml) 6.16±0.44 3.49±0.28**5.83±0.36 4.78±0.46##n = 8;**P < 0.01, vs Sham group;##P< 0.01, vs I/R group

重庆医科大学博士研究生学位论文2.3 TMZ 对 MI/R 术后大鼠心肌组织结构的影响通过HE染色评估TMZ对MI/R术后大鼠心肌组织结构的影响。如图1.3所示：Sham 组心肌细胞整齐分布，胞核位于肌纤维的中央。I/R 组中可观察到明显的变化如心肌结构严重变形、间质水肿、心肌细胞坏死和核溶解等。I/R + TMZ 组可见心肌正常结构大部分保存，间质水肿、心肌细胞坏死较 I/R 组少。HE 染色表明 TMZ可以改善 MI/R 术后大鼠心肌组织结构。

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本文编号：2813848