乙醛脱氢酶2（ALDH2）的心肌保护作用及调控机制研究

发布时间：2020-09-08 19:33

　　 研究背景酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy,ACM)是一种特殊的心肌病,常发生在长期大量饮酒的人群中。ACM的病理特点包括心肌肥厚、心肌收缩功能降低(左心室肥大、左心室射血分数降低),心肌纤维化和心肌细胞凋亡。研究表明血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)参与了 ACM的发病机制,降低AngⅡ水平可以减轻酒精诱导的心肌损伤。在心脏局部肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)中,AngⅡ由血管紧张素原(Angiotensinogen,AGT)通过肾素、血管紧张素转化酶或糜蛋白酶合成。研究证据表明,在猪的心脏中,大约75%的Ang Ⅱ来自于心脏局部的血管紧张素Ⅰ的转化,而不是血液中的血管紧张素Ⅰ。研究表明,心肌局部RAS在ACM的病理过程中发挥重要的作用。在ACM中,小鼠心肌细胞中的Ang Ⅱ诱发许多生理病理反应,包括氧化应激、心肌细胞凋亡和心肌重构。但目前在ACM中,如何减少心肌局部RAS中的AGT和Ang Ⅱ还尚不清楚。近年来,线粒体乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)被认为是一种重要的心肌保护酶,它能够明显降低缺血再灌注、糖尿病、酒精等引起的心肌损伤。研究发现,ALDH2介导的包括乙醛在内的细胞毒性醛的解毒,可能是减轻酒精损伤的保护机制。有研究表明,小鼠过表达ALDH2能够有效的改善慢性酒精摄入引起的醛类累积、心肌肥厚和心肌收缩功能降低。另有研究发现,在心肌肥大细胞中,由蛋白激酶Cε(Protein kinase Cε,PKCε)激活的ALDH2通过抑制心肌局部RAS可减少心肌缺血再灌注损伤后的心律失常。尽管已经发现ALDH2能够改善ACM,但ALDH2是否通过抑制心肌局部RAS来改善酒精诱导的心肌损伤,还有待于进一步研究。P38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAP kinase,p38 MAPK),是丝裂原活化蛋白激酶家族的成员之一,参与了多种信号传导通路。cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)作为 p38 MAPK 的下游信号分子,能够与DNA结合调节基因的转录。有研究表明,长期酒精摄入能够升高大脑皮层中p38 MAPK磷酸化水平,而过表达ALDH2可以抑制这一过程。研究发现,在ACM中,过表达ALDH2可通过降低CREB的磷酸化水平进而抑制心肌肥厚。另一研究表明,在高糖条件下,磷酸化的p38 MAPK和CREB都能够增加AGT表达导致细胞的肥大,但p38 MAPK并不能调控CREB。然而,在ACM中,ALDH2能否通过抑制p38 MAPK/CREB通路进而减少心肌局部RAS中的AGT和Ang Ⅱ还有待于进一步研究。研究目的1.探讨在ACM中,ALDH2能否通过抑制心肌局部RAS改善酒精引起的心肌损伤;2.探讨在ACM中,p38 MAPK/CREB通路是否参与了 ALDH2对心肌局部RAS的调控。研究方法1.小鼠ACM模型的建立8周龄的雄性C57BL/6J小鼠用Lieber-DeCarli液体饲料喂养2个月。实验随机分为5组(n=10):对照组(Con)、空载体组(Vehicle)、酒精组(ETOH)、酒精+Alda-1 组(ETOH+Alda-1)、酒精+Daidzin 组(ETOH+Daidzin)。ETOH 组的小鼠使用含有5%酒精的Lieber-DeCarli液体饲料,酒精供能比例占36%。Con组和Vehicle组小鼠用不含酒精的对照液体饲料喂养。用Alzet渗透压泵给小鼠持续腹腔泵入ALDH2激活剂Alda-1(10 mg/kg/天),ALDH2抑制剂Daidzin(50 mg/kg/天),维持2个月。2.心脏超声使用Vevo770 imaging system评估小鼠心功能。1.5%的异氟烷吸入法麻醉小鼠后,在M超下检测左心室舒张末期直径(Left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)和左心室收缩末期直径(Left ventricular end-systolic dimension,LVESD),并计算左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)。3.组织学和形态学心肌组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋并切片。麦胚凝集素染色(Wheat germ agglutinin,WGA)用于评估心肌纤维的横截面积。使用Masson染色和天狼星红染色来评估心肌纤维化水平。4.TUNEL法凋亡染色心肌组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋并切片。TUNEL染色用于评估心肌细胞凋亡。5.乳大鼠原代心肌细胞的提取和培养用0.05%的胰蛋白酶和0.04%的胶原酶消化并提取2日龄Wistar大鼠的原代心肌细胞。将原代心肌细胞暴露于不同剂量的酒精(10-400 mmol/L)或Ang Ⅱ(1-1000 nmol/L)的培养基中培养24 h检测ALDH2的表达和活性。在随后的实验中,我们选择400 mmol/L酒精作为干预条件,并在培养基中加入ALDH2激活剂(Alda-1,20 μmol/L),ALDH2 抑制剂(Daidzin,50 μmol/L),p38 MAPK 抑制剂(SB203580,10 μmol/L),p38 MAPK 激活剂(Anisomycin,10 μmol/L)或CREB抑制剂(KG-501,25 μmol/L)做进一步研究。6.ALDH2腺病毒转染将原代心肌细胞以1-2×106个细胞/孔的密度接种到六孔板中,并且以60的感染复数转染ALDH2过表达腺病毒。通过在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的表达及免疫印迹(Western blotting)验证转染效率。7.Western blotting 检测将30μg的组织蛋白或原代细胞蛋白样品进行SDS-PAGE电泳、转膜、一抗孵育、二抗孵育、化学发光。检测 ALDH2、AGT、phospho-p38 MAPK、p38 MAPK、phospho-CREB、CREB 的表达水平。p38MAPK、CREB、GAPDH、β-tubulin 的表达水平作为内参。8.ALDH2酶活性分析提取出的线粒体用超声裂解后,4℃以11000 ×g的转速超速离心10 min,取上清。通过检测ALDH2代谢NAD+生成NADH的量反映ALDH2酶活性。9.醛类分析心肌组织或原代心肌细胞用PBS匀浆后,900 ×g离心10 min,取50μL的上清或醛类标准品(1-1000 μmol/L)加入到黑色96孔板中,加入50 μ的AldeLightTM蓝色反应液,室温避光孵育15 min,加入25 μL的反应缓冲液。荧光分光光度计检测Ex/Em = 365/435 nm。10.酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测Ang Ⅱ浓度首先用BCA法对提取出来的心肌组织蛋白或细胞蛋白定量,然后用ELISA法检测蛋白中Ang Ⅱ的浓度。结果1.在ACM中,酒精升高心脏中AGT和Ang Ⅱ的水平动物实验中,与Con组相比,ETOH组小鼠心肌的AGT和Ang Ⅱ分别增加了 1.4倍和1.9倍。细胞实验中,10-400 mmol/L酒精引起原代心肌细胞AGT和Ang Ⅱ的增加,在400 mmol/L时增加最明显。2.在ACM中,心脏中ALDH2活性受到抑制动物实验中,与Con组相比,ETOH组小鼠的心肌中的ALDH2表达水平没有变化。但是ETOH组小鼠心肌的ALDH2活性明显降低。与Con组相比,ETOH组小鼠心肌的醛类的累积明显增多。细胞实验中,10-400 mmol/L酒精并没有改变原代心肌细胞中的ALDH2的表达量。但是高剂量酒精(100 mmol/L和400 mmol/L)明显抑制了原代心肌细胞中ALDH2的活性。而低剂量酒精(10 mmol/L和40 mmol/L)升高了原代心肌细胞中ALDH2活性。另外,400 mmol/L酒精显著增加原代心肌细胞中醛类的累积。3.在ACM中,ALDH2通过减少AGT和Ang Ⅱ改善酒精引起的心肌损伤动物实验发现,与ETOH组相比,ETOH+Alda-1组小鼠的LVEF增加了 15.9%。与ETOH组相比,ETOH+Alda-1组小鼠的心肌细胞肥大减轻,心肌纤维化明显减轻。ETOH+Alda-1组小鼠心肌细胞凋亡较ETOH组降低了 28.1%。ETOH+Alda-1组小鼠心肌中的醛类也较ETOH组明显减少。ETOH+Alda-1组小鼠心肌的AGT比ETOH组降低了 29.7%。ETOH+Alda-1组小鼠心肌的Ang Ⅱ比ETOH组降低了 46.6%。另外,与ETOH组相比,ETOH+Daidzin组小鼠心肌损伤更严重,醛类累积更多。与ETOH组相比,ETOH+Daidzin组小鼠心肌的AGT和Ang Ⅱ水平更高。细胞实验发现,与ETOH组相比,ETOH+Alda-1组原代心肌细胞的AGT和AngⅡ分别降低了 27.8%和26.9%。与ETOH组相比,ETOH+Daidzin组原代心肌细胞的AGT和Ang Ⅱ分别升高了 16.6%和37.3%。与ETOH组相比,ETOH+Ad-ALDH2组原代心肌细胞的AGT和Ang Ⅱ明显减少了 44.5%和27.5%。另外,不同浓度的Ang Ⅱ(1-1000nmol/L)并没有改变原代心肌细胞中ALDH2的表达量和活性。4.在ACM中,酒精通过激活心脏中p38 MAPK/CREB通路升高AGT和Ang Ⅱ动物实验发现,与Con组相比,ETOH组小鼠心肌的phospho-p38 MAPK/总p38 MAPK比例升高了 1倍,phospho-CREB/总CREB比例升高了 1.4倍。细胞实验发现,与Con组相比,ETOH组原代心肌细胞的phospho-p38 MAPK/总p38 MAPK和phospho-CREB/总CREB比例分别增加了 1.4倍。与ETOH组相比,P38 MAPK抑制剂SB203580明显抑制酒精引起的phospho-CREB/总CREB比例的增多,达48.3%。而CREB抑制剂KG-501并没有抑制酒精引起的phospho-p38 MAPK/总p38 MAPK比例的升高。与ETOH组相比,ETOH+SB203580组原代心肌细胞的AGT降低了 25.1%,ETOH+KG-501组原代心肌细胞的AGT降低了25.5%。与ETOH组相比,ETOH+SB203580组和ETOH+KG-501组原代心肌细胞的Ang Ⅱ都明显减少。5.在ACM中,ALDH2抑制酒精激活的p38 MAPK/CREB通路动物实验发现,与ETOH组相比,ETOH+Alda-1组小鼠心肌的phospho-p38 MAPK/总p38 MAPK比例降低了 23.6%,ETOH+Daidzin组小鼠心肌的phospho-p38 MAPK/总 p38 MAPK 比例升高了 36.3%。小鼠心肌的 phospho-CREB/总CREB比例也发现了类似趋势的变化。细胞实验发现,与ETOH组相比,ETOH+Alda-1组原代心肌细胞的phospho-p38 MAPK/总 p38 MAPK 比例降低了 29.7%,ETOH+Daidzin 组原代心肌细胞的phospho-p38 MAPK/总p38 MAPK比例升高了 27.3%。与ETOH组相比,ETOH+Alda-1组原代心肌细胞的phospho-CREB/总CREB比例降低了 28.1%,ETOH+Daidzin组原代心肌细胞的phospho-CREB/总CREB比例升高了 18.5%。与ETOH组相比,ETOH+Ad-ALDH2组原代心肌细胞的phospho-p38 MAPK/总p38 MAPK 比例和 phospho-CREB/总 CREB 比例分别降低了 28.1%和 42.6%。6.在ACM中,ALDH2通过抑制p38 MAPK/CREB通路减少AGT和Ang Ⅱ与ETOH+Alda-1组相比,ETOH+Alda-1+Anisomycin组原代心肌细胞的AGT和 Ang Ⅱ各升高了 53.8%和 96.9%。与 ETOH+Alda-1+Anisomycin 组相比,ETOH+Alda-1+Anisomycin+KG-501 组原代心肌细胞的 AGT 和 AngⅡ各降低了34.7%和49.2%。Anisomycin减弱了Alda-1降低AGT和AngⅡ的作用,而KG-501又改善了这一过程。上述结果表明在ACM中,ALDH2通过抑制p38 MAPK/CREB通路进而降低AGT和Ang Ⅱ水平。结论1.在ACM中,ALDH2通过减少心肌局部RAS中的AGT和Ang Ⅱ改善酒精引起的心肌损伤;2.在ACM中,ALDH2通过抑制p38 MAPK/CREB通路进而减少心肌局部RAS中的AGT和AngⅡ。研究背景急性心肌梗死(Acute myocardialinfarction,AMI)是一种全世界范围内患病率和致死率都很高的人类疾病。AMI病人的预后受许多危险因素的影响。在这些危险因素中,不管是否由糖尿病引起的高血糖都会导致AMI病人的预后不良。有证据表明,在心脏缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)过程中,高血糖是加剧心功能障碍,增加心肌梗死面积,加重心肌细胞凋亡的独立危险因素。尽管有这些发现,但高血糖加重心脏I/R损伤的机制仍有很多未知。过度的血糖升高导致蛋白分子的氧连接的氮乙酰葡萄糖胺(O-linked-N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)修饰。O-GlcNAc 糖基化修饰是发生在蛋白质丝/苏氨酸残基的翻译后修饰,由己糖胺途径生成并分解。研究发现多种胞质蛋白、核蛋白和线粒体蛋白都可以发生O-GlcNAc糖基化修饰。蛋白分子的O-GlcNAc糖基化修饰可以调节它们自身的结构和功能,从而影响信号级联反应和抗氧化等生物过程。然而,某些蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰是否参与了高血糖加重心脏I/R损伤的机制仍不清楚。线粒体乙醛脱氢酶 2(Mitochondrial aldehyde dehydrogenase2,ALDH2)被发现是一种重要的心肌保护酶。在心脏I/R过程中,升高ALDH2活性可显著减小心肌梗死面积,而抑制ALDH2活性后增大心肌梗死面积。在心脏I/R过程中,ALDH2对心肌的保护可能是通过对4-羟基壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)等毒性醛的解毒作用完成的。另一研究发现,高血糖能够抑制糖尿病大鼠心脏中ALDH2活性。尽管ALDH2分子中存在丝/苏氨酸残基,但在高血糖条件下ALDH2是否发生O-GlcNAc糖基化修饰导致自身活性降低,从而加重心脏I/R损伤,有待于进一步研究。研究目的1.探讨在高糖条件下,ALDH2是否发生了 O-GlcNAc糖基化修饰;2.探究ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰在高血糖加重心脏I/R损伤中的作用。研究方法1.动物实验过程成年雄性Wistar大鼠随机分为6组:假手术(Sham)组,生理盐水+缺血再灌注(NS+I/R)组,急性高血糖+缺血再灌注(AHG+I/R)组,糖尿病+缺血再灌注(DM+I/R)组,DM组和DM+I/R+Alda-l组,每组10只。用戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,气管插管后连接小动物呼吸机辅助通气。开胸后,结扎I/R组大鼠的前降支30 min后再灌注90 min。Sham组大鼠:静脉注射生理盐水(4mL/kg/h)。NS+I/R组大鼠:静脉注射生理盐水(4mL/kg/h)。AHG+I/R组大鼠:弹丸式注射5%葡萄糖溶液(1.5 mg/kg),后静脉注射维持(4 mL/kg/h)。DM组大鼠:腹腔注射链脲佐菌素(60 mg/kg),一个月后做后续的研究。ALDH2激活剂Alda-1结扎前10 min以8mg/kg静脉注射。在I/R过程中每10 min检测尾静脉血糖一次。2.心功能检测I/R完成后,用微导管通过右颈动脉插入大鼠左心室,测量左心室舒张末期压力(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP),左心室收缩末期压力(left ventricular end systolic pressure,LVESP)和左心室压力上升最大速率(left ventricular maximal rate of pressure increase,+LVdp/dtmax)和左心室压力下降最大速率(left ventricular maximal rate of pressure decrease,-LVdp/dtmax)。检测心功能后,迅速心脏取材,置于-80℃冰箱保存或者4%多聚甲醛固定。3.TTC染色通过TTC染色检测心脏的心肌梗死面积。4.H9c2心肌细胞培养和缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)过程将H9c2心肌细胞培养在含10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素的低糖DMEM培养基中。H9c2心肌细胞给予低糖(5mmol/L葡萄糖+25mmol/L甘露醇)或者高糖(30 mmol/L葡萄糖)处理。在葡萄糖糖浓度依赖实验中,葡萄糖浓度范围是 5 mmol/L 至 35 mmol/L。H9c2心肌细胞在缺氧条件(1%02,94%N2和5%C02)下培养12 h后再在正常氧浓度下(95%空气和5%CO2)培养2h。在H/R过程中给予ALDH2激活剂(Alda-1,10 μmol/L),O-GlcNAc 糖基化修饰抑制剂(DON,50 μmol/L)或 O-GlcNAc 糖基化修饰激活剂(PUGNAc,100μmol/L)。5.人心肌组织的获取心肌组织来自3位糖尿病和3位非糖尿病遗体捐献者的左心室。捐献者不限于年龄,性别,人种的差别。糖尿病病史通过捐献者的疾病史采集获得。捐献者的死因与心脏病无关。这些资料在遗体捐献前由捐献者家属提供。6.组织学和形态学收集结扎点以下的心肌组织。4%多聚甲醛浸泡固定后用石蜡包埋心肌组织,并将心肌组织切成4 μm的薄片后进行HE染色。7.TUNEL法凋亡染色在动物实验中,心肌组织的凋亡用组织化学方法通过凋亡试剂盒检测。在细胞实验中,用免疫荧光方法通过凋亡检测试剂盒检测H9c2心肌细胞的凋亡。8.免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)和免疫印迹(Western blotting)分析大约500 μg的组织蛋白或细胞蛋白样品与2-10 μg ALDH2或COX Ⅰ或NDFUA9一抗4 ℃孵育过夜,再加入20μL琼脂糖珠子,4 ℃孵育2 h。孵育完后用裂解液清洗琼脂糖珠子,加入1×蛋白上样缓冲液后煮沸5min。30 μg或20μL蛋白通过10%SDS-PAGE电泳、转膜、一抗孵育(β-actin,O-GlcNAc,ALDH2,COXI,NDUFA9,4-HNE)、洗膜 3 次后孵育二抗、化学发光。9.ALDH2活性检测提取出的线粒体用超声裂解后,4 ℃以1000 ×g的转速超速离心10 min,取上清。通过检测ALDH2代谢NAD+生成NADH的量反映ALDH2酶活性。10.蛋白羰基检测提取大鼠心肌组织或H9c2心肌细胞中的蛋白,检测蛋白的羰基修饰水平。11.醛类分析心肌组织或者H9c2心肌细胞用PBS匀浆后,900 ×g离心10 min,取50 μL的上清或醛类标准品(1-1000 μmol/L)加入到黑色96孔板中,每孔中加入50μL AldeLightTM蓝色反应液,室温下避光孵育15 min,后加入25μL的反应缓冲液。荧光分光光度计检测Ex/Em = 365/435 nm。结果1.高血糖加重大鼠心肌I/R损伤与NS+I/R组相比,AHG+I/R组和DM+I/R组大鼠的LVEDP明显升高,LVESP,+LVdp/dtmax和-LVdp/dtmax显著降低,心肌梗死面积增大,心肌细胞凋亡增多。2.在心脏I/R出现高血糖过程中,大鼠心脏中的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰增多与Sham组相比,I/R过程没有增加大鼠心肌总蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰。然而,与NS+I/R组相比,AHG+I/R组和DM+I/R组大鼠心肌总蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰明显增多。与Sham组相比,NS+I/R组大鼠心肌中的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰略有增多,且没有统计学差异。与NS+I/R组相比,AHG+I/R组和DM+I/R组大鼠心肌ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰各增多了 2.29倍和2.67倍。与Sham组相比,NS+I/R组、AHG+I/R组和DM+I/R组大鼠心脏ALDH2表达没有明显的差异。与Sham组相比,NS+I/R组大鼠心肌中ALDH2活性没有显著变化。与NS+I/R组相比,AHG+I/R组大鼠心肌ALDH2活性降低了 17.2%,DM+I/R组大鼠心肌ALDH2活性降低了 19.2%。3.高糖增加ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰在遗体捐献者的心脏中,糖尿病组的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰较非糖尿病组明显升高28.3%。在糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠心脏中也发现了相似的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰的变化趋势。高糖处理H9c2心肌细胞48 h引起ALDH2 O-糖基化修饰增加60.8%。随着培养基中葡萄糖浓度的升高(5-35 mmol/L),H9c2心肌细胞的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰逐渐增高,30 mmol/L和35 mmol/L高糖培养H9c2心肌细胞的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰明显增高,有统计学差异。在遗体捐献者的心脏中,糖尿病组的ALDH2活性较非糖尿病组降低了15.9%。与非糖尿病大鼠比较,糖尿病大鼠心脏ALDH2活性降低了 19.6%。在细胞实验中,随着葡萄糖浓度的升高,ALDH2活性有降低的趋势。在30mmol/L和35 mmol/L时,ALDH2活性显著降低。4.ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰影响ALDH2活性细胞实验中,与Con组相比,PUGNAc组ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰增加62.9%,DON组ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰减少44.1%。与Con组相比,PUGNAc组ALDH2活性降低18.1%,DON组ALDH2活性升高17.9%。与Con组相比,HG+PUGNAc组ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰增加了 1.16倍,高糖单独增加ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰比例达66.2%。这意味着在高糖条件下,PUGNAc仍然能增加ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰。HG+DON组ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰降到了基础水平。与Con组比较,ALDH2活性在高糖条件下明显降低。与HG组相比,HG+PUGNAc组ALDH2活性明显降低,而HG+DON组ALDH2活性恢复到正常水平。我们进一步明确了在H/R条件下,PUGNAc和DON能否调控ALDH2活性。细胞实验分为 Con+H/R 组,Con+PUGNAc+H/R 组,Con+DON+H/R 组,HG+H/R组,HG+PUGNAc+H/R 组,HG+DON+H/R 组。ALDH2 O-GlcNAc 糖基化修饰和ALDH2活性的变化趋势与非H/R处理的6个组的趋势是一致的。5.ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰导致4-HNE、醛和蛋白羰基修饰增多,心肌细胞凋亡加重在动物实验中,与Sham组相比,NS+I/R组的4-HNE稍有增多,AHG+I/R组和DM+I/R组的4-HNE明显增多。醛类累积和蛋白羰基修饰的变化趋势与4-HNE一致。在细胞实验中,与Con组相比,HG组的4-HNE明显增多。HG+H/R组的4-HNE较HG组明显增多。与HG组和HG+H/R组相比,HG+H/R+DON组的4-HNE显著降低。醛类累积和蛋白羰基修饰的变化趋势与4-HNE 一致。与Con组相比,HG组与HG+H/R组的心肌细胞凋亡指数升高。与HG组和HG+H/R组相比,HG+H/R+DON组的心肌细胞凋亡指数显著降低。6.Alda-1降低ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰并改善了心肌I/R损伤我们检测了 Con组、HG组、HG+H/R组和HG+H/R+Alda-1组H9c2心肌细胞的ALDH2活性。与Con组比较,HG组和HG+H/R组的ALDH2活性明显降低。与HG组和HG+H/R组比较,HG+H/R+Alda-1组的ALDH2活性明显升高。与 HG 组和 HG+H/R 组相比,HG+H/R+Alda-1 组 ALDH2 O-GlcNAc 糖基化修饰明显降低。在动物实验中,与DM组和DM+I/R组相比,DM+I/R+Alda-1组大鼠心肌中ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰显著降低。与DM+I/R组相比,DM+I/R+Alda-1组大鼠的LVEDP明显降低,LVESP、+LVdp/dtmax和-LVdp/dtmax明显升高,心肌梗死面积显著减小,心肌细胞凋亡显著改善。结论1.高糖引起ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰增多;2.ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰增多导致ALDH2活性降低,并加重心脏I/R损伤;3.Alda-l抑制了 ALDH2 O-GlcNAc糖基化修饰,改善了高糖加重的心脏I/R损伤。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.2
【部分图文】：

图１．大量酒精摄入引起心功能降低、心肌肥厚、心肌纤维化和心肌细胞凋亡。逡逑（Ａ）邋ＬＶＥＦ。（Ｂ）邋ＷＧＡ染色检测心肌横截面积（标尺，２０0ｎｍ）。（Ｃ和Ｄ）马逡逑松染色和天狼星红染色分别检测心肌纤维化水平（标尺，２００（ｉｍ）。（Ｅ）邋ＴＵＮＥＬ逡逑法检测心肌细胞凋亡水平（标尺，１００邋ＨｍＸＣｏｎ，对照组；ＥＴＯＨ，酒精组。＊Ｐ＜０．０５逡逑ｖｓ．邋Ｃｏｎ组。全部数据均采用均数士标准误（Ｍｅａｎ士ＳＥＭ）表示（ｎ＝３－５）。逡逑３８逡逑

图２．大量酒精摄入引起心脏中的ＡＧＴ和Ａｎｇ邋ＩＩ升高。（Ａ）心肌组织中ＡＧＴ的逡逑表达量。（Ｂ）心肌组织中Ａｎｇ邋ＩＩ的表达量。（Ｃ）原代心肌细胞中ＡＧＴ的表达量。逡逑（Ｄ）原代心肌细胞中Ａｎｇ邋ＩＩ的表达量。Ｃｏｎ，对照组；ＥＴＯＨ，酒精组。＊Ｐ＜０．０５逡逑ｖｓ．邋Ｃｏｎ组。全部数据均采用均数土标准误（Ｍｅａｎ土ＳＥＭ）表不（ｎ＝３－５）。逡逑３９逡逑

图３．在ＡＣＭ中，心肌的ＡＬＤＨ２活性受到抑制。（Ａ）心肌组织中ＡＬＤＨ２的表逡逑达量。（Ｂ）心肌组织中ＡＬＤＨ２的活性。（Ｃ）原代心肌细胞中ＡＬＤＨ２表达量。逡逑（Ｄ）原代心肌细胞中ＡＬＤＨ２活性。（Ｅ）心肌组织中醛类累积。（Ｆ）原代心肌逡逑细胞中醛类累积。Ｃｏｎ，对照组；ＥＴＯＨ，酒精组。＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．Ｃｏｎ组。全部数逡逑４０逡逑

本文编号：2814554