PDGF-BB通过SIRT3影响糖酵解途径调控肺动脉平滑肌细胞的表型转化
发布时间：2020-09-14 16:22
目的明确血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)刺激诱导肺动脉平滑肌细胞表型转化是否与有氧糖酵解相关及其机制。方法1、细胞模型的建立及实验分组采用组织贴块法培养大鼠原代肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),分组实验中以PDGF-BB作为刺激因子,采用糖酵解途径的抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-DG),将PASMCs分为空白对照组、PDGF-BB(30ng/ml)组、PDGF-BB(30ng/ml)+2-DG(10mmol/l)组;在慢病毒过表达实验中,将PASMCs分为空白对照组、PDGF-BB(30ng/ml)组、PDGF-BB(30ng/ml)+去乙酰化酶sirtuin-3(SIRT3)过表达组、PDGF-BB(30ng/ml)+空载体组。2、检测相关指标使用蛋白免疫印迹(Western Blot)及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肺动脉平滑肌细胞中平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)、α-肌动蛋白(α-SMA)、钙调蛋白(calponin)、波形蛋白(vimentin)等表型指标的表达。使用细胞免疫荧光染色检测α-SMA表达水平。使用EDU检测PASMCs增殖情况。使用Western Blot检测PDGF-BB刺激后SIRT3的表达。在慢病毒过表达实验中,使用Western Blot、qRT-PCR检测葡萄糖转运蛋白-1(Glut1)及有氧糖酵解酶的表达水平。结果PDGF-BB刺激12小时后,大鼠肺动脉平滑肌细胞合成表型指标vimentin mRNA及蛋白水平升高(P0.05),而收缩表型指标α-SMA、SM-MHC、calponin mRNA及蛋白表达水平则明显降低(P均0.05),但2-DG逆转了PDGF-BB的这种作用。细胞免疫荧光实验及EDU增殖实验显示,PDGF-BB减少α-SMA阳性细胞,并导致PASMCs显著增殖,而2-DG可逆转该过程。此外,PDGF-BB刺激细胞后,SIRT3蛋白表达显著低于空白对照组(P0.05)。慢病毒过表达SIRT3实验中,与空白对照组相比,PDGF-BB可显著增加Glut1及有氧糖酵解酶己糖激酶2(HK2)、磷酸果糖激酶3(PFKFB3)mRNA及蛋白表达(P均0.05);过表达SIRT3可显著抑制PDGF-BB对Glut1及糖酵解酶的影响(P均0.05);但PDGF-BB+空载体组Glut1和糖酵解酶的mRNA及蛋白的表达水平则与PDGF-BB组比较无统计学意义(P均0.05)。结论PDGF-BB通过SIRT3促进有氧糖酵解调控肺动脉平滑肌细胞的表型转化。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R544.1
【部分图文】：
图2.3.2 PDGF-BB通过糖酵解影响细胞表型转化（1:空白对照组，2：PDGF-BB组，3：PDGF-BB+2-D组）AWestern Blot 观察各组表型指标的蛋白表达水平；B qRT-PCR 观察各组表型指标的 mRNA 达水平：与空白对照组相比，aP 均<0.05，n=3；与 PDGF-BB 组相比，bP 均<0.05，n=3。C 各组鼠肺动脉平滑肌细胞α-肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光染色结果（1：空白照组，2：PDGF-BB 组，PDGF-BB+2-DG 组 ×400）：绿色代表α-SMA 阳性细胞，蓝色代表细胞核。与空白对照组相比，PDGF-BB 组α-SMA 阳性细胞明显减少；与 PDGF-BB 组相比，PDGF-BB+2-DG 组α-SMA 阳性细相对增多。Figure 2.3.2 PDGF-BB affects cell phenotype transformation through glycolytic pathway2.3.3 PDGF-BB 通过糖酵解影响细胞的增殖EDU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，基于 EDU 与荧光染特异性反应的原理，能够快速检测细胞 DNA 复制的活性，可适用于细胞增殖、细胞化、生长发育、DNA 修复等很多方面的研究。本实验应用 EDU 检测细胞增殖情况。使用糖酵解途径的抑制剂 2-DG 干预细胞 2h，即阻断了糖酵解途径，再用 PDGF-BB 激细胞 12h，我们可以清楚地观察到 PDGF-BB 组细胞增殖数高于空白对照组PDGF-BB+2-DG组细胞增殖数低于PDGF-BB组。结果证实了PDGF-BB可促进PASM
图 2.3.3 各组大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖情况的 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EDU）染色结果（1：空白对照组，2：PDGF-BB 组，3：PDGF-BB+2-DG 组 ×400）：红色代表 EDU 阳性细胞，蓝色代表总细胞核。与空白对照组相比，PDGF-BB组EDU阳性细胞明显增多，代表细胞增殖数增高；与PDGF-BB组相比，PDGF-BB+2-DG 组 EDU 阳性细胞明显减少，代表细胞增殖数下降。Figue 2.3.3 EDU observes the proliferation of PASMCs2.3.4 PDGF-BB 降低 SIRT3 的表达水平SIRT3 是第一个被定位于哺乳动物细胞线粒体的 Sirtuin，在富含线粒体的组织中高表达。为了探究 PDGF-BB 对 SIRT3 的影响，用 PDGF-BB 刺激细胞 12h，Western blot结果显示PDGF-BB组SIRT3蛋白表达水平显著低于空白对照组（0.43±0.06比1.00±0.00，P < 0.05）。提示 PDGF-BB 可抑制 PASMCs 中 SIRT3 的表达水平。（图 2.3.4）
结果显示PDGF-BB组SIRT3蛋白表达水平显著低于空白对照组（0.43±0.06比1.00±0.00，P < 0.05）。提示 PDGF-BB 可抑制 PASMCs 中 SIRT3 的表达水平。（图 2.3.4）图2.3.4 各组大鼠肺动脉平滑肌细胞SIRT3表达水平的Western Blot结果（1：空白对照组，2：PDGF-BB组）：与空白对照组相比，aP<0.05，n=3。Figure 2.3.4 Western Blot observes the expression level of SIRT3 protein2.3.5 慢病毒载体过表达 SIRT3前期实验提示 PDGF-BB 刺激细胞后，SIRT3 表达水平明显下降，并且也证实了PDGF-BB 可通过糖酵解诱导肺动脉平滑肌细胞的表型转化及增殖，那么 PDGF-BB、
本文编号：2818385
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R544.1
【部分图文】：
图2.3.2 PDGF-BB通过糖酵解影响细胞表型转化（1:空白对照组，2：PDGF-BB组，3：PDGF-BB+2-D组）AWestern Blot 观察各组表型指标的蛋白表达水平；B qRT-PCR 观察各组表型指标的 mRNA 达水平：与空白对照组相比，aP 均<0.05，n=3；与 PDGF-BB 组相比，bP 均<0.05，n=3。C 各组鼠肺动脉平滑肌细胞α-肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光染色结果（1：空白照组，2：PDGF-BB 组，PDGF-BB+2-DG 组 ×400）：绿色代表α-SMA 阳性细胞，蓝色代表细胞核。与空白对照组相比，PDGF-BB 组α-SMA 阳性细胞明显减少；与 PDGF-BB 组相比，PDGF-BB+2-DG 组α-SMA 阳性细相对增多。Figure 2.3.2 PDGF-BB affects cell phenotype transformation through glycolytic pathway2.3.3 PDGF-BB 通过糖酵解影响细胞的增殖EDU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，基于 EDU 与荧光染特异性反应的原理，能够快速检测细胞 DNA 复制的活性，可适用于细胞增殖、细胞化、生长发育、DNA 修复等很多方面的研究。本实验应用 EDU 检测细胞增殖情况。使用糖酵解途径的抑制剂 2-DG 干预细胞 2h，即阻断了糖酵解途径，再用 PDGF-BB 激细胞 12h，我们可以清楚地观察到 PDGF-BB 组细胞增殖数高于空白对照组PDGF-BB+2-DG组细胞增殖数低于PDGF-BB组。结果证实了PDGF-BB可促进PASM
图 2.3.3 各组大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖情况的 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EDU）染色结果（1：空白对照组，2：PDGF-BB 组，3：PDGF-BB+2-DG 组 ×400）：红色代表 EDU 阳性细胞，蓝色代表总细胞核。与空白对照组相比，PDGF-BB组EDU阳性细胞明显增多，代表细胞增殖数增高；与PDGF-BB组相比，PDGF-BB+2-DG 组 EDU 阳性细胞明显减少，代表细胞增殖数下降。Figue 2.3.3 EDU observes the proliferation of PASMCs2.3.4 PDGF-BB 降低 SIRT3 的表达水平SIRT3 是第一个被定位于哺乳动物细胞线粒体的 Sirtuin，在富含线粒体的组织中高表达。为了探究 PDGF-BB 对 SIRT3 的影响，用 PDGF-BB 刺激细胞 12h，Western blot结果显示PDGF-BB组SIRT3蛋白表达水平显著低于空白对照组（0.43±0.06比1.00±0.00，P < 0.05）。提示 PDGF-BB 可抑制 PASMCs 中 SIRT3 的表达水平。（图 2.3.4）
结果显示PDGF-BB组SIRT3蛋白表达水平显著低于空白对照组（0.43±0.06比1.00±0.00，P < 0.05）。提示 PDGF-BB 可抑制 PASMCs 中 SIRT3 的表达水平。（图 2.3.4）图2.3.4 各组大鼠肺动脉平滑肌细胞SIRT3表达水平的Western Blot结果（1：空白对照组，2：PDGF-BB组）：与空白对照组相比，aP<0.05，n=3。Figure 2.3.4 Western Blot observes the expression level of SIRT3 protein2.3.5 慢病毒载体过表达 SIRT3前期实验提示 PDGF-BB 刺激细胞后，SIRT3 表达水平明显下降，并且也证实了PDGF-BB 可通过糖酵解诱导肺动脉平滑肌细胞的表型转化及增殖，那么 PDGF-BB、
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 邱梅红;张锐;郑杨;张尉华;;实验性肺动脉高压大鼠心室间糖酵解代谢相关基因筛选和差异[J];中华心血管病杂志;2014年12期
本文编号：2818385
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