琥珀酸受体GPR91作为心肌缺血缺氧损伤防治靶点的研究

发布时间：2020-09-17 21:03

　　近年来,心脑血管疾病发病率呈上升趋势。2012年世界卫生组织的统计数据显示,全球每年因心血管疾病死亡人数高达1740万,成为威胁人类健康的最重要疾病之一。心肌缺血、缺氧多见于心脏冠脉供血不足或高原缺氧环境等情形,若缺血、缺氧持续存在,则会导致心肌损伤,影响心脏功能。因此,心肌缺血、缺氧性疾病的发生发展及防治措施研究,一直是心血管疾病研究领域的重要内容。G蛋白偶联受体(G protein-coupled-receptor,GPCR)是位于细胞膜的蛋白分子,结构特征表现为跨膜七次,激活时与胞内的G蛋白分子发生偶联,是迄今为止最重要的药物发现靶点。GPCR配基的种类较多,包括生物胺、肽类、脂类、氨基酸、气味等,但糖代谢中间产物也能成为GPCR的特异配基令人颇感意外。琥珀酸(盐)是三羧酸循环的中间产物,直至将它鉴定为GPCR成员GPR91(G protein-coupled receptor 91)的特异性配基,才赋予了它更重要的角色,预示着琥珀酸(盐)不仅参与能量代谢过程,而且具有相应的生理功能和病理意义。有研究认为,在肝脏供血不足时血压升高与琥珀酸的血液浓度增加有关,同时琥珀酸还参与了肾素释放的调节而导致血压升高。最新的研究结果发现心脏组织中亦存在大量GPR91表达,提示GPR91很可能与心脏功能密切相关。基于以上研究背景,本课题主要开展了两部分的研究工作:第一部分,利用冠脉结扎所致大鼠心肌缺血模型及模拟高原环境所致大鼠心肌低氧模型,研究在缺血、缺氧情况下GPR91的mRNA及蛋白的表达变化及大鼠心肌组织的病理改变;第二部分,体外培养乳鼠原代心肌细胞,制备低氧培养乳鼠原代心肌细胞模型,通过siRNA干扰技术降低细胞内GPR91的表达,观察原代心肌细胞的生存状态及心肌损伤BNP、PI3K、下游信号分子Akt及磷酸化改变,验证GPR91是否参与心肌缺血、缺氧病理改变过程。第一部分:制备冠脉结扎所致大鼠心肌缺血模型及模拟高原环境所致大鼠心肌低氧模型,通过PCR和Western blot检测GPR91的mRNA及蛋白的表达变化水平。为了诱发心肌缺血大鼠模型,将大鼠心脏左冠状动脉前降支结扎一定时间,同时设置假手术组,即结扎线仅穿过左冠状动脉前降支但不进行结扎。结果发现,与假手术组大鼠的心肌组织相比,冠状动脉结扎12h、24h组大鼠GPR91的mRNA和蛋白表达水平,均出现明显上调(P0.01、P0.05)。模拟高原环境所致大鼠心肌低氧模型中,与正常气压组相比,低气压1d、3d、5d和7d组大鼠心肌细胞中GPR91的mRNA表达水平明显升高(P0.05),且其蛋白表达水平在7d后也明显升高(P0.05);通过分析心肌组织病理切片,低气压1d组心肌细胞出现变性肿胀,3d及5d可见炎性细胞浸润,7d后可见心肌变性肿胀断裂,胞核不清。免疫组织化学结果显示,低氧环境大鼠心肌组织GPR91的表达呈现上升趋势,表明GPR91参与了心肌缺血、缺氧损伤的病理过程。第二部分:我们首先原代培养新生大鼠心肌细胞,予以低氧处理,再利用siRNA干扰技术降低细胞内GPR91的表达,观察心肌细胞的存活状态及PI3K/Akt通路的变化。低氧环境下可见心肌细胞存活率降低,ATP含量减少,BNP及CaMK II表达上调;较之对照组,siRNA干扰组心肌细胞GPR91的表达水平被抑制,与此同时,还可检测到心肌细胞存活率上升、ATP含量增多、BNP及CaMK II蛋白表达下调、PI3K及下游信号分子Akt磷酸化水平降低(P0.05)。提示GPR91可能通过调控PI3K-Akt的磷酸化介入了心肌缺血损伤的病理过程。综上所述,本研究从体内和体外两方面证实,GPR91与缺血、缺氧引发的心肌损伤有关,介入了后者的发生发展过程,且这一影响可能是GPR91通过调控PI3K-Akt的磷酸化进而参与心肌缺血损伤的病理过程实现的。本研究对于探讨冠状动脉供血不足、高原环境缺氧所致的心肌疾病的防治,具有较强的理论和现实意义,同时也为靶向GPR91药物的发现研究提供了依据。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R542.2
【部分图文】：

标准曲线,标准曲线,标准品,浓度

标准曲线的配制：BSA 标准品浓度（μ g/ml） 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 稀释液（μ l） 0 25 25 25 25 25 BSA 标准品（μ l 25 25 0 0 0 0 标曲浓度（μ g/ml） 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 0标曲 OD 值 0.526 0.327 0.227 0.173 0.147 0.132 0.12标曲 OD 值 0.469 0.340 0.229 0.186 0.148 0.134 0.12均值 0.498 0.334 0.228 0.180 0.148 0.133 0.12校准值 0.371 0.207 0.101 0.053 0.021 0.006 0.00根据标准品浓度及标准品 OD 值，可得出下列标准曲线，计算蛋白含量（

心电图,心电图变化,电生理变化,大鼠

图的变化组大鼠比较，心脏冠脉结扎 12 h 及 24 h 大鼠的心电图均出现现为 ST 段弓背型抬高，为典型的心肌缺血电生理变化。各组图变化结果如图 2-2 所示。

左心室,血清,大鼠

-3. 冠脉结扎心肌缺血模型大鼠心脏左心室梗死面积的变化（x s, n=3）2-3. Changes in left ventricular infarct size in rats with coronary artery ligation andmyocardial ischemia ( x±s，n=3 )血清 LDH、CK 和 cTn-T 含量的变化 2-2 结果可见，与假手术组相比，心脏冠脉结扎 12 h、24 h 组大鼠的CK 和 cTn-T 含量显著增加（P<0.01）；与 12h 组相比，结扎 24 h H 和 cTn-T 含量亦明显增加（P<0.01）。

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