地西他滨诱导骨髓增生异常综合征细胞发生铁死亡及其机制的研究

发布时间：2020-09-18 17:06

　　 第一部分地西他滨诱导骨髓增生异常综合征细胞发生铁死亡及其机制目的骨髓增生异常综合征(MDS)是常见的骨髓衰竭综合征,多伴铁过载;铁死亡是调节性细胞死亡的形式之一,具有独立的形态、生化及遗传特性,可能参与MDS的发生和发展,有望成为治疗的新靶点。地西他滨是治疗MDS的经典去甲基化药物之一。本项研究拟探讨其是否能诱导MDS细胞发生铁死亡及其作用机制。方法1.细胞系SKM-1、MUTZ-1分别与地西他滨及铁死亡抑制剂Fer-1共培养,CCK-8法检测药物在不同时间、不同浓度下对细胞活力的影响,同时观察Fer-1、necrostatin-1(程序性坏死特异性抑制剂)、z-vad-fmk(凋亡特异性抑制剂)及DFO(铁螯合剂)能否逆转地西他滨对细胞的抑制作用。CCK-8法检测铁死亡诱导剂erastin联合地西他滨对MUTZ-1细胞活性的影响;2.流式细胞术检测Fer-1、DFO、erastin单药或联合地西他滨作用于SKM-1、MUTZ-1细胞后ROS水平的变化;3.生化法检测地西他滨及Fer-1、DFO处理MUTZ-1细胞后谷胱甘肽(GSH)含量变化;生化法检测地西他滨、Fer-1、GSH、necrostatin-1、z-vad-fmk处理MUTZ-1细胞后谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)活性的变化。结果1.Necrostatin-1、z-vad-fmk可显著增加MUTZ-1的细胞活力,necrostatin-1可显著增加SKM-1的细胞活力(P0.05),Fer-1、necrostatin-1、DFO均可部分逆转地西他滨对SKM-1、MUTZ-1细胞的生长抑制作用,其中铁死亡抑制剂Fer-1的逆转作用最为显著(P0.05);erastin联合地西他滨组细胞活力低于erastin单药组和地西他滨单药组,尽管协同作用不显著(Q1.15);2.地西他滨作用于SKM-1、MUTZ-1后细胞内ROS水平增高,且可被铁死亡特异性抑制剂Fer-1及铁螯合剂DFO抑制。Erastin、地西他滨共培养组可使细胞内ROS水平进一步增加;3.地西他滨可使MUTZ-1细胞内GSH含量明显降低,可被Fer-1逆转。地西他滨可使MUTZ-1细胞内GPXs活性下降,该作用可被Fer-1、necrostatin-1、z-vad-fmk或外源性GSH逆转。结论1.MDS的发病机制可能主要涉及程序性坏死与凋亡,地西他滨诱导MDS细胞死亡的主要方式可能是程序性坏死与铁死亡;2.地西他滨可引起铁死亡相关性ROS水平增加;3.地西他滨可能通过降低细胞内GSH含量及GPXs活性诱导MDS细胞发生铁死亡。第二部分铁过载诱导小鼠骨髓单个核细胞发生铁死亡目的MDS患者常伴有铁过载,本研究拟通过构建C57BL/6小鼠铁过载模型,观察铁过载是否能诱导铁死亡的发生,为铁过载患者的治疗提供新思路。方法1.C57BL/6小鼠腹腔注射右旋糖酐铁,构建小鼠铁过载模型;2.通过ELISA法检测小鼠外周血铁蛋白水平,肝、脾病理切片显示铁沉积以验证铁过载模型是否成功构建;共聚焦显微镜显示小鼠骨髓单个核细胞内二价铁离子的数量,流式细胞术定量检测荧光强度;3.检测外周血血红蛋白数量,观察铁过载程度与贫血程度之间是否存在线性关系;4.Fer-1(铁死亡抑制剂)、necrostatin-1(程序性坏死抑制剂)、z-vad-fmk(凋亡抑制剂)、erastin(铁死亡诱导剂)、DFO(铁螯合剂)分别作用于小鼠骨髓单个核细胞,CCK-8法检测各组细胞活力,流式细胞术检测ROS水平的变化,生化法检测谷胱甘肽(GSH)含量及谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)活性的变化。结果1.通过给小鼠腹腔注射右旋糖酐铁成功建立了小鼠铁过载模型;2.铁过载导致肝脏、脾脏、骨髓铁沉积,外周血血红蛋白(Hb)下降;铁过载小鼠骨髓单个核细胞内二价铁离子数量显著高于对照组;小鼠外周血血红蛋白浓度与细胞内Fe2+水平、铁蛋白浓度均呈负相关;3.铁过载可导致细胞活力降低,细胞活力与细胞内Fe2+水平呈负相关;4.Fer-1、necrostatin-1可部分逆转铁过载组细胞活力的下降,erastin可促进铁过载小鼠骨髓单个核细胞增殖(P0.05);5.铁过载小鼠骨髓单个核细胞内ROS水平显著增加(P0.05),细胞内GSH含量及GPXs活性下降。铁螯合剂可提高细胞内GSH水平,铁死亡抑制剂、凋亡抑制剂及铁螯合剂可显著增加高剂量铁剂组小鼠BMMNCs的GPXs活性(P0.05)。结论1.铁过载可导致小鼠贫血,且贫血程度与铁过载程度呈正相关;2.程序性坏死与铁死亡可能在铁过载小鼠的细胞活力减低中发挥一定的作用;3.随着铁过载程度的加重,细胞内Fe2+的水平及ROS水平增加;4.Erastin可促进铁过载小鼠骨髓单个核细胞增殖;5.铁过载可能导致程序性坏死及铁死亡相关性ROS升高;6.铁螯合剂可提高铁过载小鼠BMMNCs内GSH水平;7.铁过载导致的GPXs活性下降可能与铁死亡及凋亡相关;第三部分地西他滨诱导MDS患者骨髓单个核细胞发生铁死亡目的分别探讨铁死亡在低危及高危MDS患者发病机制中的作用,为MDS的治疗提供理论依据。方法1.分别提取低危MDS、高危MDS及淋巴瘤患者的骨髓单个核细胞,与地西他滨共培养,同时观察Fer-1、necrostatin-1(程序性坏死特异性抑制剂)、z-vad-fmk(凋亡特异性抑制剂)及DFO(铁螯合剂)能否逆转地西他滨对三组细胞的抑制作用。CCK-8法检测铁死亡诱导剂erastin联合地西他滨对三组细胞活性的影响;2.流式细胞术检测三组患者骨髓单个核细胞(BMMNCs)内ROS水平;生化法检测细胞内谷胱甘肽(GSH)的含量与谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)活性。结果1.Fer-1、necrostatin-1、z-vad-fmk均可显著逆转地西他滨对低危BMMNCs的抑制作用(P0.05),necrostatin-1和Fer-1可较为明显地逆转地西他滨对高危BMMNCs的抑制作用,尽管差异不显著(P0.05);2.地西他滨可导致MDS患者细胞内ROS水平显著增加(P0.05),Fer-1可显著抑制该作用(P0.05),erastin可增加该作用(低危组P0.05,高危组P0.05);3.对于低危MDS患者,Fer-1、necrostatin-1、z-vad-fmk能显著逆转地西他滨对GSH水平的抑制作用(P0.05),对于高危MDS患者,Fer-1、necrostatin-1能显著逆转地西他滨对GSH水平的抑制作用(P0.05)。Erastin联合地西他滨可导致GSH水平进一步降低,在高危MDS组差异显著;4.对于低危MDS组,Fer-1、z-vad-fmk联合地西他滨组的GPXs活性较地西他滨组显著升高(P0.05),erastin可使GPXs活性进一步下降(P0.05)。对于高危MDS组,Fer-1、necrostatin-1联合地西他滨组的GPXs活性较地西他滨组显著升高(P0.05),erastin可使GPXs活性进一步下降(P0.05)。结论1.地西他滨在低、高危MDS患者中的作用机制可能有差异,在低危MDS患者中以诱导铁死亡及凋亡为主,在高危MDS患者中以诱导程序性坏死及铁死亡为主;2.地西他滨通过诱导MDS患者BMMNCs细胞内ROS水平的增加导致细胞发生铁死亡;3.对于低危MDS患者,地西他滨通过诱导BMMNCs发生程序性坏死、铁死亡、凋亡导致GSH水平降低。对于高危MDS患者,地西他滨通过诱导程序性坏死、铁死亡导致GSH水平降低;4.地西他滨主要通过铁死亡、凋亡抑制低危MDS细胞内GPXs活性,通过铁死亡、程序性坏死抑制高危MDS细胞内GPXs活性。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R551.3
【部分图文】：

图 1：GPX4 利用谷胱甘肽清除脂质过氧化物[6]常综合征（MDS）是最为常见的成人获得性骨髓衰特征，是髓系肿瘤的异质性集合。其主要特征包括少、易转化为急性髓系白血病（AML）等，总体生病率为 3-4/105[8]。患病率随年龄的增长而增加，例病率为 7-35/105，男性高于女性[8]。示，50%-80%的 MDS 患者存在铁过载，祛铁治疗。MDS 患者发生铁过载的机制主要包括：（1）输血

14图 2 地西他滨诱导铁死亡现象与其作用浓度及时间的关系（*P＜0.05）1.2.2 不同细胞死亡方式抑制剂及地西他滨对 MDS 细胞活力的影响为观察 Fer-1（铁死亡特异性抑制剂）、necrostatin-1（程序性坏死抑制剂） 、z-vad-fmk （凋亡抑制剂）、DFO（铁离子螯合剂）对地西他滨抑制细胞活力的影响，设立对照组、地西他滨组、地西他滨+Fer-1 组、地西他滨+necrostatin-1 组、地西他滨+z-vad-fmk 组、地西他滨+DFO 组及单用各细胞死亡抑制剂组，分别作用于 MUTZ-1、SKM-1 细胞 48 小时，CCK-8 法检测各组细胞活力(图 3A)。结果显示，necrostatin-1、z-vad-fmk 单药可显著增加 MUTZ-1 的细胞活力，

天津医科大学硕士学位论文necrostatin-1 单药可显著增加 SKM-1 的细胞活力（P<0.05）；necrostatin-1、Fer-1和 DFO 均可部分逆转地西他滨对 MUTZ-1、SKM-1 细胞的生长抑制，Fer-1 的作用最为显著（P<0.05），而 z-vad-fmk 则无此作用。说明 MDS 的发病机制可能主要涉及程序性坏死与凋亡，地西他滨诱导 MDS 细胞死亡的主要方式可能是程序性坏死与铁死亡。

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本文编号：2821932