阿霉素心肌纤维化模型构建及其机制探讨

发布时间：2020-09-18 18:26

　　 研究背景与目的:阿霉素(Doxorubicin,Dox)是使用最广泛的蒽环类抗肿瘤药物,疗效显著,但因具有严重心脏毒性,临床应用受限。长期以来,阿霉素心脏毒性研究甚多,具体哪一种机制起主导作用尚未明确。阿霉素作用于心肌组织最严重的后果是导致正常心肌组织的凋亡和坏死,最终心肌细胞被纤维组织取代,形成以肌成纤维细胞增多为特点的心肌纤维化。心肌纤维化是心肌重构的主要内容。内皮间质转化(Endothelial to mesenchymal transition,EndoMT)是指内皮细胞受到损伤后可向间质细胞转化,最近有研究表明内皮间质转化在纤维化疾病中具有重大的作用。本研究目的:通过1.构建化疗药物阿霉素诱导Sprague Dawley(SD)大鼠心肌纤维化模型。2.揭示内皮间质转化参与阿霉素诱导的SD大鼠心肌纤维化的形成,探讨阿霉素心肌病形成的新机制,为阿霉素心肌病的防治提供新的策略。方法:SD大鼠共48只,雌雄各半,年龄6周,体重180g左右。随机分为3个实验组和1个对照组(control),实验组大鼠采用盐酸阿霉素2mg/kg/周的剂量给予腹腔注射一次,对照组给予等量的生理盐水,分别于注射后0day,1W,2W,6W后取材。根据取材时间将实验组分为阿霉素1W,2W和6W组(DOX-1W,DOX-2W和DOX-6W)。1.应用HE染色和Masson三色染色方法检测SD大鼠心肌组织病理形态学改变。2.通过NCBI Primer-Blast法设计引物,RT-qPCR方法检测纤维化相关基因Col1α、Col3α、TGF-β1 mRNA表达。3.应用免疫组织化学法检测心肌组织TGF-β1表达。4.应用羟脯氨酸试剂盒检测方法检测阿霉素诱导的SD大鼠心脏组织中羟脯氨酸(HYP)含量。5.免疫荧光染色验证阿霉素毒副作用导致的心肌组织EndoMT现象。结果:1.大鼠腹腔注射阿霉素(2mg/kg,每周1次)后,所有大鼠均出现毛发稀少,腹部膨隆,毛发色泽差,约有1/3的大鼠因急性心率失常而死亡。2.随着阿霉素作用时间的延长,阿霉素6W组大鼠均出现心包积液和腹腔积液。HE染色和Masson三色染色结果表明阿霉素心肌病大鼠出现显著的心室腔扩大、心壁变薄、心肌纤维间隙增宽、心肌溶解、心肌纤维化、心肌血管内皮损伤和通透性增加等病理形态学改变。实验组相比于对照组心肌纤维化程度明显(P0.05)。3.RT-qPCR结果显示实验组相比于对照组纤维化相关因子Col1α、Col3α和TGF-β1的表达增多(P0.05)。阿霉素心肌组织TGF-β蛋白明显增加。4.随着阿霉素作用时间的延长,心肌羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量逐渐升高,6W组相比于1W,2W含量显著升高,实验组与对照组相比意义显著(P0.05)。5.阿霉素心肌纤维化大鼠心脏血管内皮细胞出现内皮间质转化现象。结论:1.阿霉素可诱导SD大鼠形成不可逆的心肌纤维化,本课题成功构建了阿霉素心肌纤维化模型。2.内皮间质转化参与SD大鼠阿霉素心肌纤维化的形成,在阿霉素心肌纤维化形成中起重要作用。预防或者治疗内皮间质转化可能成为治疗阿霉素心肌纤维化的有效手段。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R542.2;R730.53
【部分图文】：

图 3.1 control 组和 DOX-6W 组大鼠心脏 HE 染色图片ig 3.1 HE staining for doxorubicin induced cardiac fibrosis.A. 对照组和 DOX-6W组大鼠脏 HE 染色整体图片。B. 对照组和 DOX-6W 组大鼠心脏切片 HE 染色显微镜下放大 50倍、200 倍图片。.2.2 Masson 染色结果实验组大鼠腹腔注射阿霉素之后，随着累计剂量增加，实验组 SD 大鼠较控

图 3.2 阿霉素诱导心肌组织中胶原产生Fig 3.2 Collagen production in doxorubicin induced cardiac fibrosis.A.Masson 染色检测心脏横截面纤维化胶原表达情况。B. 每组 Masson 染色图像的纤维面积与心脏总面积之比.(x_±s，n =6) *P<0.05 与对照组比较. **P<0.01 与对照组比较.IPP 统计可得正常组心肌纤维比率为 1.99±0.56%，DOX-1W 组纤维化比率为8.75±1.03%，DOX-2W 组纤维化比率为 12.34±1.69%，DOX-6W 组纤维化比率为22.06±2.97；DOW-6W 组大鼠心肌间质及血管周围胶原面积显著高于对照组（P<0.05）；（图 3.2B）。3.3 心肌组织胶原纤维基因表达细胞外基质的过量产生和沉积是心肌纤维化的主要特点。纤维化组织中胶原纤维的主要成分为 I 型胶原和 III 型胶原。qPCR 检测结果显示对照组大鼠心肌组织心肌纤维化相关基因 Col1α mRNA 的相对表达量为 1.40±0.27，DOX-1W 组的

图 3.3 阿霉素诱导心肌纤维化相关基因的表达ig 3.3 doxorubicin-induced cardiac fibrosis-related gene expression.A, Col1αmRNA 表达水平。. B, Col3α mRNA 表达水平.(x_±s，n =6)*P<0.05 与对照组比较..4 纤维化因子 TGF-β1 的基因和蛋白表达纤维化因子 TGF-β1qPCR 的检测结果显示：对照组 SD 大鼠心肌组织GF-β1mRNA 的相对表达量为 1.10±0.26（n=6）；DOW-1W 组的相对表达量为.22±0.47（n=6），DOW-2W 组的相对表达量为 2.20±0.60（n=6），DOW-6W 组表达为 19.80±3.23，显著高于对照组（P<0.05）（图 3.4A）。免疫组织化学染色示，TGF-β1 阳性表达呈棕黄色颗粒状，位于细胞质中。对照组大鼠心肌组织GF-β1 相对表达量很少（图 3.4B），DOW-1W 组相对表达量较少（图 3.4C），OW-2W 组相对表达量较多（图 3.4D），DOW-6W 组相对表达量很多（P<0.05)图 4E）。

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本文编号：2822009