双调蛋白促进心肌梗死后心肌纤维化的机制研究

发布时间：2020-11-08 16:12

　　 目的心肌纤维化(Cardiac fibrosis,CF)是心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后心肌重构的发生过程,与心力衰竭密切相关。已表明双调蛋白(Amphiregulin,AR)与其他脏器纤维化发生相关。但目前AR与MI后CF之间的关系仍不明确。因此,本研究主要探讨AR与MI后CF之间的关系及具体分子机制。方法和结果1、MI后心脏巨噬细胞分泌AR。1)建立小鼠MI模型,应用Elisa、WB、RT-PCR及IF技术发现第7天时梗死边缘区、血液及心脏巨噬细胞中AR表达明显增高;2)体外TGF-β1刺激巨噬细胞后,RT-PCR及WB技术表明TGF-β1激活巨噬细胞MAPK通路导致AR分泌。2、AR诱导巨噬细胞M2极化。1)体外AR刺激BMDMs后巨噬细胞M2极化并分泌TGF-β1,此外,WB技术表明EGFR通路被激活,用EGFR抑制剂处理后TGF-β1表达明显下调;2)收集AR刺激BMDMs后的细胞上清(CM)与成纤维细胞共培养,WB、RT-PCR、IF及Transwell小室技术发现CM导致成纤维细胞激活。3、AR通过激活MI后心脏EGFR信号通路导致CF的发生及心功能的降低。1)体外AR处理成纤维细胞后可激活成纤维细胞和EGFR信号通路,而EGFR抑制剂可明显改善成纤维细胞和下游通路的激活水平;2)体内实验分Sham组,MI组、MI-shNC及MI-shAR组,其中慢病毒是在建MI模型时注射进入梗死心肌周边。(1)GFP荧光表明慢病毒注射成功,同时WB及RT-PCR技术表明慢病毒可下调第7天边缘区AR的表达;(2)28天内MI-shAR组小鼠生存率较MI组高;(3)小动物超声结果表明MI-shAR组小鼠心功能明显好转,而心衰指标明显降低;(4)取28天各组小鼠心脏后,应用RT-PCR、WB、天狼猩红染色、马松三色染色以及IF技术表明MI-shAR组小鼠的梗死边缘区纤维化面积及ECMs分泌明显减少;(5)取7天各组小鼠的心脏,应用TUNEL染色表明三组MI小鼠心肌细胞凋亡无明显差异,同时WB技术表明AR诱导CF通过EGFR信号通路。结论本研究表明,MI后心脏巨噬细胞分泌大量AR,其后AR刺激巨噬细胞分泌TGF-β1促进CF,另一方面激活成纤维细胞EGFR信号通路参与CF。本研究揭示了AR与MI后CF之间的关系并探讨具体机制,为MI后抗CF治疗提供新靶点。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

图 2 TGF-β1 诱导巨噬细胞分泌 AR(a) WB 检测结果表明，TGF-β1 刺激后，BMDMs 明显高表达 AR，12h 达到高峰，且与对照组相比具有统计学差异，而成纤维细胞表达则无明显改变。（b）RT-PCR 结果与 WB 结果显示，即 BMDMs在TGF-β1 的刺激下高表达AR，而成纤维细胞则无明显改变。（c）收集 TGF-β1刺激两种细胞不同时间点的细胞上清，Elisa 检测 AR 的分泌水平，结果与 WB 结果相一致，即在 TGF-β1 的刺激下，BMDMs 可以分泌 AR 因子，而心脏成纤维细胞的分泌水平没有显着变化。** P <0.01；*** P <0.001。Fig.2 AR was secreted from macrophages after stimulated by TGF-β13.3 TGF-β1 诱导巨噬细胞分泌双调蛋白部分通过激活 MAPK 信号通路为了观察 TGF-β1 是否通过激活 MAPK 信号通路诱导 AR 分泌，用 TGF-β1

31图 3 TGF-β1 部分通过 MAPK 信号通路诱导巨噬细胞分泌 AR（a） TGF-β1 刺激 BMDMs 15，30，60min 后，提取蛋白检测 MAPK 通路的蛋白表达水平。WB 的结果表明 p38 和 JNK 磷酸化水平均在 15min 开始上升，30min 达高峰且与对照组对比具有明显的统计学意义，随后表达开始下调。（b-c） TGF-β1 刺激 BMDMs 后 AR 因子的分泌及 mRNA 表达水平可明显的被 p38（SB）和 JNK（SP）的抑制剂下调。** P <0.01；***P <0.001。 SP = SP600125，SB = SB202190。

图 1 AR 诱导巨噬细胞向 M2 极化BMDMs 细胞用不同浓度的 AR 重组蛋白因子刺激 24h，收集细胞，RT-PCR 检测细胞炎症因子表达水平。（a-d）AR 能减低 BMDMs 的炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β1、iNOS）表达水平，且在浓度为 100pg/ml 时，降低水平最明显，且与对照组比具有统计学差异。（e, f）AR能提高 BMDMs 的抗炎因子(Arg-1、IL-10）表达水平，且在浓度 100pg/ml 时，增加水平最明显，且与对照组比具有统计学差异。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Fig. 1 BMDMs transformed to M2 polarization after AR stimulation3.2 双调蛋白诱导巨噬细胞分泌 TGF-β1研究表明，AR 可以导致多个脏器发生纤维化，然而 AR 对于 MI 后 CF 的发生是否有关仍未知。MI 后第 7 天心脏巨噬细胞是修复型巨噬细胞，可分泌大量的促纤维化因子 TGF-β1。此外，第一部分的结果已经表明 AR 刺激巨噬细胞后
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本文编号：2875017