甲羟戊酸途径中的酶在心肌缺血再灌注损伤中作用的研究

发布时间：2020-11-11 17:31

　　 第一部分抑制法尼基焦磷酸盐合成酶可以改善培养的大鼠心脏源性H9c2细胞的缺氧/复氧损伤研究背景:心肌梗死(MI)能够通过持续的缺血在病理上引起心肌细胞死亡,是冠心病(CHD)的最严重的表现形式。及时恢复冠脉血供是其重要的治疗手段。然而,研究表明恢复血供的过程中会进一步加重心脏的损伤,即缺血再灌注(IR)损伤,占心肌梗死引起的死亡率的四分之一。法尼基焦磷酸盐合成酶(FPPS)是甲羟戊酸途径中的一种关键酶。它在类异戊二烯的生物合成中具有非常重要的作用,可以催化异戊烯焦磷酸盐和牻牛儿基焦磷酸盐合成法尼基焦磷酸盐(FPP)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸盐(GGPP)。FPP和GGPP在小G蛋白的活化中具有非常重要的作用。已有研究表明FPPS在小鼠心肌肥厚、'纤维化和心室重塑的过程中起着非常重要的作用。但其对心肌缺血再灌注损伤的作用尚不清楚。另有研究表明小G蛋白Racl在心肌缺血再灌注损伤中具有非常重要的作用。目的:本实验使用大鼠心脏来源的H9c2细胞,对其进行缺氧/复氧处理,体外模拟心肌缺血再灌注的过程。探索FPPS表达量改变对心肌缺血再灌注损伤的影响及相应的机制。方法:(1)体外培养H9c2细胞,用FPPS过表达质粒及其RNA干扰质粒分别转染培养的细胞。用real-time PCR及western blot鉴定转染后的细胞FPPS的表达水平。(2)转染后的细胞给予缺氧8小时后复氧4小时的处理。(3)用CCK法测定缺氧/复氧后细胞的存活率。(4)用乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒分别测定培养基中LDH的释放量和细胞裂解产物中SOD的水平。(5)用流式细胞仪测定缺氧/复氧后不同组细胞的凋亡率。(6)用G-Lisa法测定小G蛋白Racl的活性。(7)用ROS试剂盒检测缺氧/复氧后细胞中ROS的水平。结果:(l)FPPS过表达质粒使细胞FPPS表达水平明显增加,RNA干扰的质粒使细胞FPPS的表达水平显著降低。(2)FPPS过表达使细胞缺氧/复氧后存活率明显降低,抑制FPPS表达使缺氧/复氧后细胞的存活率增加。(3)FPPS过表达使缺氧/复氧后培养基中LDH释放量明显升高,细胞裂解产物中SOD的量显著降低,而抑制FPPS表达与其有相反的作用。(4)FPPS过表达使缺氧/复氧后细胞的凋亡率显著增加,抑制FPPS表达使缺氧/复氧后细胞的凋亡率显著下降。(5)FPPS过表达可使缺氧/复氧细胞的小G蛋白Racl的活性明显增加,抑制FPPS的表达可明显降低缺氧/复氧细胞的小G蛋白Racl的活性。(6)FPPS过表达使缺氧/复氧后细胞ROS的产生量明显增加,抑制FPPS的表达使缺氧/复氧后细胞的ROS产生量显著降低。结论:FPPS过表达可加重H9c2细胞缺氧/复氧损伤,抑制FPPS表达可改善其损伤程度,该现象可能与小G蛋白Racl的活性改变,进而引起ROS产生量的改变有关。第二部分法尼基焦磷酸盐合成酶过表达加重小鼠心肌缺血再灌注损伤研究背景:缺血性心脏病是全球性致死和致残的一个重要原因,及时恢复冠脉血供是其重要的治疗手段。然而,研究表明恢复血供的过程中会进一步加重心脏的损伤,即缺血再灌注(IR)损伤,占心肌梗死引起的死亡率的四分之一。法尼基焦磷酸盐合成酶(FPPS)是甲羟戊酸途径中的一种关键酶。它在类异戊二烯的生物合成中具有非常重要的作用,可以催化异戊烯焦磷酸盐和牻牛儿基焦磷酸盐合成法尼基焦磷酸盐(FPP)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸盐(GGPP)。FPP和GGPP在小G蛋白的活化中具有非常重要的作用。本研究第一部分已证实FPPS过表达加重缺氧/复氧诱导的培养的大鼠心脏源性的H9c2细胞的损伤,抑制FPPS表达对缺氧/复氧诱导的H9c2的损伤有保护作用。该现象与小G蛋白Racl的活性增加从而增加ROS的产生有关。另有研究表明小G蛋白Racl在心肌缺血再灌注损伤中具有非常重要的作用。而GGPP为Racl的激活提供类异戊烯化基团。目的:本研究利用转基因小鼠模型研究和探讨FPPS过表达对心肌缺血再灌注损伤的影响及其相应的作用机制。方法:(1)FPPS转基因小鼠来自本课题组。用real-time PCR、western-blot等方法检测转基因小鼠心脏组织中FPPS mRNA及蛋白的表达水平。(2)使用Langendorff装置构建FPPS转基因小鼠及野生小鼠的缺血再灌注损伤模型,并使用生物信号采集系统记录缺血再灌注过程中心功能、心率的变化。(3)使用肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定灌流液中CK和LDH的水平。(4)使用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定心肌梗死面积。(5)使用G-Lisa方法测定心脏组织中小G蛋白Racl的表达水平。(6)使用活性氧(ROS)试剂盒测定心脏组织中ROS的量。结果:(1)FPPS转基因小鼠心脏组织中FPPSmRNA及蛋白的表达量明显升高。(2)心脏特异性的FPPS过表达降低了缺血再灌注损伤后心功能的恢复水平,而对心率无明显影响。(3)心脏特异性的FPPS过表达使缺血再灌注过程中灌流液中CK和LDH释放量增加。(4)心脏特异性的FPPS过表达使缺血再灌注损伤后心肌梗死面积明显增加。(5)心脏特异性的FPPS过表达使缺血再灌注过程中小G蛋白Racl的活性增加。(6)心脏特异性的FPPS过表达增加了缺血再灌注过程中ROS的产生量。结论:FPPS过表达可以加重小鼠心肌缺血再灌注损伤,其机制可能与小G蛋白Racl活性增加,进而增加ROS的产生,加重心肌细胞的坏死和凋亡有关。第三部分牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸盐合成酶对培养的大鼠心脏源性H9c2细胞的缺氧/复氧损伤的影响研究背景:心脏缺血性疾病在恢复血供的过程中会进一步加重心脏的损伤,即缺血再灌注(IR)损伤,包括可逆性损伤和不可逆性损伤两种。IR引起的死亡率占心肌梗死引起的死亡率的四分之一。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸盐合成酶(GGPPS)可以催化合成GGPP,而GGPP在小G蛋白异戊烯化的过程中起着非常重要的作用。本研究的第一部分和第二部分证实FPPS表达量的改变可以引起小G蛋白Racl活性的改变,而后者可以改变ROS的产生,从而影响心肌缺血再灌注损伤的程度。本研究通过质粒转染的方法改变H9c2细胞GGPPS的表达量,研究GGPPS在鼠心脏源性的H9c2细胞缺氧/复氧损伤中的作用。目的本实验使用鼠心脏来源的H9c2细胞,体外模拟心肌缺血再灌注的过程。探索GGPPS表达量改变对心肌缺血再灌注损伤的影响,及相应的机制。方法:(1)构建GGPPS过表达及其RNA干扰质粒。(2)体外培养H9c2细胞,用GGPPS过表达质粒及其RNA干扰质粒分别转染培养的细胞。用real-time PCR及western blot鉴定转染后的细胞GGPPS mRNA及蛋白的表达水平。(3)转染后的细胞给予缺氧8小时后复氧4小时的处理。(4)用CCK法测定缺氧/复氧后细胞的存活率。(5)用乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒分别测定培养基中LDH的释放量和细胞裂解产物中SOD的水平。(6)用流式细胞仪测定缺氧/复氧后不同组细胞的凋亡率。(7)用G-Lisa法测定小G蛋白Racl的活性。(8)用ROS试剂盒检测缺氧/复氧后细胞中ROS的水平。结果:(1)GGPPS过表达质粒使细胞GGPPS mRNA及蛋白的表达水平明显增加,RNA干扰的质粒使其表达水平显著降低。(2)GGPPS过表达使细胞缺氧/复氧后存活率明显降低,抑制GGPPS表达使缺氧/复氧后细胞的存活率增加。(3)GGPPS过表达使缺氧/复氧后培养基中LDH释放量明显升高,细胞裂解产物中SOD的量显著降低,而抑制GGPPS表达与其有相反的作用。(4)GGPPS过表达使缺氧/复氧后细胞的凋亡率显著增加,抑制GGPPS表达使缺氧/复氧后细胞的凋亡率显著下降。(5)GGPPS过表达可使缺氧/复氧细胞的小G蛋白Racl的活性明显增加,抑制GGPPS的表达可使缺氧/复氧细胞的小G蛋白Racl的活性明显下降。(6)GGPPS过表达使缺氧/复氧后细胞ROS的产生量明显增加,抑制GGPPS的表达使缺氧/复氧后细胞的ROS产生量显著降低。结论:GGPPS过表达可加重H9c2细胞缺氧/复氧损伤,抑制GGPPS的表达可减轻其损伤,该现象的可能与小G蛋白Racl的活性改变,进而引起ROS产生量的改变有关。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

图１．３．１质粒转染后Ｈ９ｃ２细胞中ＦＰＰＳ的表达水平。（Ａ）质粒转染Ｈ９ｃ２细??胞的效果。转染效果用焚光显微镜下ＧＦＰ阳性细胞占总细胞的百分比表示。（Ｂ）??流式细胞仪测定细胞转染效率。（Ｃ）转染后４８?ｈＦＰＰＳ蛋白表达水平。内参为Ｔｕｂｕｌｉｎ。??（Ｄ）Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ结果半定量分析。结果以均数±标准误（ｍｅａｎ?±?ＳＥＭ）表示（ｎ＝３?）。??＊＊Ｐ＜?０．０１?ｖｓｐＥ－ＧＦＰ，＊＊＊Ｐ＜?０．００１?ｖｓ?ｐＥ－ＧＦＰ“Ｅ）ＲＴ－ＰＣＲ?结果?ｃ?内参为?ＧＡＰＤＨ。??结果以均数士标准误表示（ｍｅａｎ?士?ＳＥＭ）?（ｎ＝３?）。料叩＜?０．００１?ｖｓ?ｐＥ－ＧＦＰ。??２１??

图１．３．２基因扩增曲线图和溶解曲线图示例（仪器：ＡＢＩ７５００）??３．２?ＦＰＰＳ表达量的改变对缺氧／复氧后Ｈ９ｃ２细胞增殖的影响??３．２．１?ＦＰＰＳ表达量的改变对缺氧／复氧后Ｈ９ｃ２细胞存活率的影响??用质粒ｐＥ－ｍＦＰＰＳ、ｓｈＦＰＰＳ及对照质粒ｐＥ－ＧＦＰ转染Ｈ９ｃ２细胞，４８小时后??对细胞进行缺氧８小时，随后复氧４小时的处理。用ＣＣＫ试剂盒检测细胞的存活??率。结果如图１．３．３所示：与对照组相比，ＦＰＰＳ过表达细胞缺氧／复氧后（ｐＥ－ｍＦＰＰＳ??＋?ＨＲ组）存活率显著降低，ＦＰＰＳ干扰细胞缺氧／复氧后（ｓｈＦＰＰＳ?＋?ＨＲ组）存活??率明显升高。??２２??

图１．３．３Ｈ９ｃ２细胞缺氧／复氧后的存活率。结果以均数±标准误（ｍｅａｎ±ＳＥ表示（ｎ＝６）。繼Ｐ?＜?０．００１?ｖｓ?ＣＯＮ，＊Ｐ?＜?０．０５?ｖｓ?ｐＥ－ＧＦＰ?＋?ＨＲ，?＊叩?＜?０．０１?ｖｓ?ｐＥ－＋?ＨＲＸＯＮ：空白对照组；ｐＥ－ＧＦＰ：空质粒对照组；ｓｈＦＰＰＳ：?ＦＰＰＳ干扰组；ｐＥ－ｍＦＦＰＰＳ过表达组；ＨＲ：缺氧／复氧。??３．２．２?ＦＰＰＳ表达量改变对缺氧／复氧后Ｈ９ｃ２细胞凋亡的影响??用质粒ｐＥ－ｍＦＰＰＳ、ｓｈＦＰＰＳ及对照质粒ｐＥ－ＧＦＰ转染Ｈ９ｃ２细胞，４８小对细胞进行缺氧８小时，随后复氧４小时的处理。用流式细胞以检测各组细调亡率。结果如图１．３．４所不：缺氧／复氧后，Ｈ９ｃ２细胞的调亡（早期调亡和凋亡）率分别为：ｐＥ－ＧＦＰ?＋?ＨＲ?组（７．８６３?±?０．４３８％），?ｐＥ－ｍＦＰＰＳ?＋?ＨＲ?组（１５．９０．３５６％），?ｓｈＦＰＰＳ?＋?ＨＲ组（５．６００±０．１９１％）。由此看出ＦＰＰＳ过表达加重缺氧／后Ｈ９ｃ２细胞的凋亡率，干扰ＦＰＰＳ基因表达可降低其凋亡率。??
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