一、研究背景紫绀型先心病是复杂先心病的主要组成部分,心脏中存在右向左分流,慢性缺氧是其重要病理生理基础。紫绀型先心病患者的血氧饱和度较低,但是他们能够长期耐受缺氧,直至手术治疗,提示慢性缺氧可能促使心肌做出代偿改变,而且这些改变能够增强心肌细胞在缺氧条件下生存的能力。因此,寻找慢性缺氧条件下心肌细胞的代偿机制可能有助于临床上提高心肌保护策略,改善临床治疗效果。细胞自噬是通过吞噬胞质蛋白或者细胞器,然后包被进入囊泡,与溶酶体融合为自噬溶酶体,降解包被的内容物的代谢过程。在无应激条件下,基础水平的自噬有助于细胞器更新和细胞稳态的维持。在缺氧等病理条件下,自噬通过降解细胞内的蛋白质、脂质和细胞器为细胞的生命活动提供能量和营养。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是高度保守的丝/苏氨酸激酶,是细胞能量感受的关键分子。当细胞中ATP水平减少时,AMPK被活化,通过促进代谢分解和抑制代谢合成,增加ATP供应。此外,AMPK参与了自噬调控,能够通过抑制mTORC1和激活ULK1增强自噬。虽然紫绀型先心病的具体发病机制尚不清楚,但是凋亡引起的心肌细胞减少被证明在紫绀型先心病的疾病进程中具有重要意义。凋亡的调控是一个精密而复杂的过程,近期研究表明内质网应激诱导的凋亡在缺氧心肌细胞中发挥重要作用。内质网是蛋白折叠、钙储存和脂质合成的核心细胞器。在缺氧等破坏内质网稳态的刺激下,内质网中错误折叠蛋白不断累积,导致内质网应激。当细胞处于内质网应激时,代偿性的未折叠蛋白反应被激活。未折叠蛋白反应有助于恢复内质网稳态,包括三个分支:肌醇依赖性激酶1α(IRE1α,inositol-requiring protein-1α),活化转录因子6(ATF6,activating transcription factor6),和蛋白质激酶R样的内质网激酶(PERK,protein kinase RNA(PKR)-like ER kinase)。如果外源性刺激长期得不到解决,未折叠蛋白反应会导致凋亡。目前,内质网应激诱导凋亡中的机制尚不清楚。IRE1α是内质网应激信号中最为保守的感受分子。IRE1α可以激活凋亡信号调节激酶1(ASK1)和p38 MAPK,促进凋亡发生。研究表明细胞因子在人胰腺β细胞中作用于IRE1α,进而激活JNK诱导凋亡发生。IRE1α信号通路在慢性缺氧心肌细胞中的作用研究尚未见报道。沉默信息调节因子1(Sirt1,silent mating type information regulator 2 homolog-1,Sirtuin 1)是辅酶I(NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶,广泛表达在真核细胞中。Sirt1通过去乙酰化组蛋白和非组蛋白参与许多细胞活动,包括凋亡、自噬、能量限制、细胞分化、抗衰老以及DNA损伤修复。研究表明Sirt1在心肌缺血再灌注损伤、心肌肥厚、动脉粥样硬化等心血管疾病中发挥保护作用。重要的是,研究发现Sirt1发现与细胞缺氧有关,能够去乙酰化缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α。这些结果提示Sirt1可能参与慢性缺氧心肌的适应过程,但具体方式尚不清楚。基于以上文献回顾,我们提出研究假设:Sirt1可能通过调控自噬和凋亡参与了心肌细胞缺氧适应的过程。二、研究目的本项目拟在临床心肌标本检测慢性缺氧条件下凋亡和自噬相关蛋白以及Sirt1的表达变化;建立慢性缺氧细胞模型,应用腺病毒Ad-Sirt1和Ad-Sh-Sirt1实现Sirt1的过表达和干扰。在细胞水平检测Sirt1对缺氧心肌细胞自噬和凋亡的影响,以及AMPK和IRE1α信号通路关键蛋白的调控作用。建立慢性缺氧小鼠模型,运用Sirt1激动剂SRT1720和抑制剂EX-527检测其对缺氧小鼠心肌自噬和凋亡的影响。三、研究方法1.人心肌标本的收集:收集紫绀组和非紫绀组患者右室流出道组织:紫绀组为法洛四联症患者,非紫绀组为室间隔缺损合并右室流出道狭窄患者。提取组织蛋白,采用Western blot检测自噬(LC3-II和p62),凋亡(cleaved Caspase 3和Bcl2)相关蛋白和Sirt1在两组患者心肌标本中的表达情况。2.探索Sirt1在缺氧H9C2细胞自噬中的作用及调控机制:2.1建立慢性缺氧细胞模型:将无血清培养基饥饿过夜的H9C2心肌细胞置于O_2 1%,CO_2 5%,N_2 94%的细胞培养箱中培养24h,建立慢性缺氧细胞模型;常氧组氧浓度为21%。2.2检测Ad-Sirt1过表达和Ad-Sh-Sirt1干扰的效果,Ad-LacZ作为对照,并检测Sirt1对基础自噬的影响。2.3将细胞分为常氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-LacZ组,常氧+Ad-Sh-Sirt1组,缺氧+Ad-Sh-Sirt1组,检测LC3-II和p62的表达变化。2.4将细胞分为常氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-Sirt1组,缺氧+Ad-Sh-Sirt1组,检测各组心肌细胞p-AMPK和AMPK蛋白表达情况。2.5将细胞分为常氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-Sirt1组,缺氧+Ad-Sirt1+Compound C组,检测各组心肌细胞LC3-II和p62蛋白表达情况。3.研究Sirt1在慢性缺氧心肌细胞凋亡中的作用3.1将细胞分为常氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-LacZ组,缺氧+Ad-Sirt1组,缺氧+Ad-Sh-Sirt1组。Western blot检测各组心肌细胞cleaved Caspase 3和Bcl2蛋白表达情况;流式细胞仪检测各组细胞凋亡的变化情况。Western blot检测过表达和干扰Sirt1后,IRE1α和p-IRE1α蛋白的表达水平的变化。3.2运用慢病毒Lv-Sh-IRE1α干扰IRE1α表达,Ad-IRE1α过表达IRE1α,Western blot验证效率。将细胞分为Lv-Sh-Scramble+常氧组,Lv-Sh-Scramble+缺氧组,Lv-Sh-IRE1α+常氧组,Lv-Sh-IRE1α+缺氧组,Ad-LacZ+常氧组,Ad-LacZ+缺氧组,Ad-IRE1α+常氧组,Ad-IRE1α+缺氧组,共计8组。Western blot检测各组凋亡相关蛋白cleaved Caspase 3和Bcl2蛋白的表达情况。Western blot检测各组JNK、c-jun、NF-κB p65的表达及磷酸化。3.3将细胞分为Ad-LacZ+缺氧组,Ad-IRE1α+缺氧组,Ad-Sirt1+缺氧组,Ad-IRE1α+Sirt1+缺氧组,Western blot检测各组心肌细胞cleaved Caspase 3和Bcl2蛋白表达情况。Western blot检测各组JNK、c-jun、NF-κB p65的表达及磷酸化。4.研究Sirt1激动剂和抑制剂在慢性缺氧小鼠心肌细胞自噬和凋亡中的影响。4.1将8-10周龄的雄性C57BL/6J小鼠分为常氧+DMSO组,缺氧+DMSO组,缺氧+SRT1720组,缺氧+EX-527组(每组10只)。缺氧组小鼠饲养于Ruskinn低氧工作站,氧浓度为10%。常氧组氧浓度为21%。SRT1720为Sirt1激动剂,剂量为50 mg/kg/d,EX-527为Sirt1的抑制剂,剂量为10 mg/kg/d,给药方式为腹腔注射。缺氧饲养时间为2周。4.2待缺氧时间结束后,检查小鼠血红蛋白浓度和红细胞比容评估缺氧效果,同时收集小鼠心脏。免疫荧光检查常氧组和缺氧组HIF-1α表达情况。4.3 Western blot检测各组小鼠心肌组织中Sirt1、Acet-p53、p53蛋白的表达情况。4.4 Western blot检测各组小鼠心肌组织中LC3-II、p62、p-AMPK、AMPK蛋白的表达情况。免疫荧光检测各组LC3-B的表达变化。4.5 Western blot检测各组小鼠心肌cleaved Caspase 3、Bcl2、p-IRE1α、IRE1α蛋白的表达情况。TUNEL法检测各组小鼠心肌凋亡比例的变化。四、研究结果1.Western blot结果显示紫绀组患者心肌中Sirt1的表达显著高于非紫绀组。同非紫绀组相比,紫绀组中LC3-II表达明显增加而p62表达明显降低,此外紫绀组中cleaved Caspase3表达明显增加而Bcl2表达明显降低。2.同对应的Ad-LacZ组相比,Ad-Sirt1组中明显Sirt1的表达量明显上调,而Ad-Sh-Sirt1组则显著降低。Western blot检测自噬相关蛋白表达,结果表明在Ad-Sirt1组中LC3II的表达上调,而p62的表达明显下调。同缺氧对照组相比,Ad-Sh-Sirt1+缺氧组中LC3-II的表达降低,p62的表达增加。同缺氧对照组相比,Ad-Sirt1+缺氧组p-AMPK/AMPK比值增加,Ad-Sh-Sirt1+缺氧组p-AMPK/AMPK比值降低。同缺氧对照组相比,Ad-Sirt1+缺氧组中LC3-II的表达增加,p62的表达减少,当AMPK抑制剂Compound C加入后Sirt1的促自噬作用被抑制。3.利用流式细胞仪检测缺氧心肌凋亡,结果显示同缺氧对照组相比,Ad-Sirt1组的凋亡细胞所占比值明显减少,而在Ad-Sh-Sirt1组中显著增加。Western blot法检测凋亡相关蛋白,结果表明Ad-Sirt1组中cleaved Caspase 3表达显著下调,Bcl2表达显著上调,而在Ad-Sh-Sirt1组中结果相反。同对应的缺氧对照组相比,Ad-Sirt1+缺氧组p-IRE1α/IRE1α比值明显降低,Ad-Sh-Sirt1+缺氧组p-IRE1α/IRE1α比值明显增加。同缺氧对照组相比,IRE1α过表达组中cleaved Caspase 3表达增加,Bcl2的表达降低,而在IRE1α干扰组中cleaved Caspase3表达减少,Bcl2的表达增加。进一步的结果表明同对应的缺氧对照组相比,IRE1α过表达组中p-JNK/JNK、p-cjun/cjun和p-p65/p65 NF-κB的比值明显增加,而在IRE1α干扰组中p-JNK/JNK、p-cjun/cjun和p-p65/p65 NF-κB的比值明显减少。Western blot结果表明,同Ad-LacZ+缺氧组相比,Ad-IRE1α+缺氧组中p-JNK/JNK、p-cjun/cjun和p-p65/p65 NF-κB的比值明显增加,而共同过表达Sirt1后上述比值降低。4.和常氧组小鼠相比,缺氧组小鼠中血红蛋白和红细胞比容明显增加,HIF-1α免疫荧光强度明显增加。同缺氧组小鼠相比,干扰组(EX-527)中Sirt1蛋白的表达明显降低,acetyl-p53/p53的比值明显增加,而激动组(SRT1720)中Sirt1蛋白的表达明显增加,acetyl-p53/p53的比值明显降低。同缺氧组小鼠相比,干扰组中p-AMPK/AMPK的比值和LC3-II表达明显降低,p62表达水平明显增加,而在激动组中p-AMPK/AMPK的比值和LC3-II表达明显增高,而p62表达水平明显降低。LC3-B免疫荧光染色的结果表明同缺氧组相比,EX-527组中LC3-B免疫荧光强度明显降低,SRT1720组中LC3-B的免疫荧光强度明显增强。Western blot结果表明同缺氧组小鼠相比,EX-527组中p-IRE1α/IRE1α的比值和cleaved Caspase 3表达增加,Bcl2表达降低;而SRT1720组中p-IRE1α/IRE1α的比值和cleaved Caspase 3表达减少,Bcl2表达增加。TUNEL荧光染色结果表明同缺氧组小鼠相比,干扰组中凋亡细胞所占的比值明显增加,而激动组中凋亡细胞所占的比值明显减少。五、研究结论1.紫绀组患者心肌中Sirt1表达水平高于非紫绀组。紫绀组患者心肌中自噬和凋亡水平高于非紫绀组。2.在H9C2心肌细胞系中,上调Sirt1可显著增强缺氧心肌细胞自噬,Sirt1的促自噬作用与AMPK激活有关。3.在H9C2心肌细胞系中,上调Sirt1可显著减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡。IRE1α为Sirt1调控的靶蛋白,上调Sirt1表达后,缺氧心肌细胞中IRE1α/JNK/c-jun和NF-κB p65通路的激活受到抑制。4.在缺氧小鼠心肌中,药物激活Sirt1(SRT1720)能够增强自噬和缓解凋亡,而干扰Sirt1(EX-527)则会抑制自噬和加剧凋亡。
【学位单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R541.1
【部分图文】：
陆军军医大学博士学位论文果irt1 表达和凋亡在紫绀型先心病患者的心肌组织中增加测了紫绀组和非紫绀组患者心肌组织中Sirt1的表达。如图1-1和组中的表达明显高于非紫绀组（p<0.05），说明 Sirt1 在慢性缺氧我们运用 Western blot 检测了凋亡相关蛋白，包括促凋亡的 clea Bcl2 表达情况。cleaved Caspase 3 在紫绀组中高于非紫绀组（p低于非紫绀组（p<0.05）。上述结果表明，凋亡在紫绀组心肌细胞
estern blot 显示 LC3-II 和 p62 蛋白在紫绀组和非紫绀组先心病患者心肌组织图 1-3 图 1-1 和图 1-2 的统计结果，n=10，*表示同非紫绀组相比 p<0.05。
31stern blot 检测各组中 Sirt1，LC3-II，p62 的表达水平。*表示同 Ad-LacZ 组相 干扰 Sirt1 对缺氧心肌细胞自噬的影响究 Sirt1 在缺氧诱导自噬中的作用，我们观察了 Sirt1 被干扰后在缺。如图 2-2 所示，同 Ad-LacZ+缺氧对照组相比，Ad-Sh-Sirt1+缺氧降低（p<0.05），而 p62 的表达明显增加（p<0.05）。表明，缺氧条自噬水平受到抑制。
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2879613
