黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇改善氧化应激介导的糖尿病动物心房重构

发布时间：2020-11-12 04:37

　　 目的心房颤动(房颤,AF)的发病机制十分复杂,包括炎症,氧化应激及钙稳态异常等。黄嘌呤氧化酶(XO)是嘌呤代谢过程的关键酶,其过度激活可使体内氧化应激水平升高。在本研究中,我们探讨了氧化应激和钙调控异常与心房电重构及结构重构的关系,以及黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇对以上病理过程的干预作用。方法本研究的动物实验部分应用了两种糖尿病动物模型:糖尿病兔模型和糖尿病大鼠模型。将90只成年大耳白兔随机分为3组:对照组(C,n=30),糖尿病组(DM,n=30)及别嘌呤醇干预组(ALLO,n=30),以四氧嘧啶溶液经兔耳缘静脉注射建立糖尿病兔模型。将成年雄性SD大鼠随机分为3组:对照组(n=30),糖尿病组(n=30)及别嘌呤醇干预组(n=30),以链脲佐菌素经大鼠尾静脉注射建立糖尿病大鼠模型。别嘌呤醇干预组在糖尿病模型建立成功后开始给药,药物干预时间为8/6周。在糖尿病兔/大鼠模型建立成功8/6周后,对各组动物进行在体心脏超声检查及血流动力学检测,取血清及组织标本,测定血清氧化应激指标,包括黄嘌呤氧化酶、一氧化氮、超氧化物歧化酶及丙二醛等。通过离体心脏灌流进行电生理研究,测定各组动物心房间传导时间,房室传导周期,心房有效不应期及房颤诱发率。通过马松染色观察心房间质纤维化水平,通过HE染色观察心房肌细胞排列情况。通过免疫组化观察心房组织XO表达情况,通过western blot法检测氧化应激(XO,Mn-SOD),心肌纤维化及其上游相关蛋白(TGF-β,p-38,P-p38,JNK,P-JNK,ERK,P-ERK)、钙通道调控蛋白(Cav_(1.2),RyR_2,SERCA_(2a),NCX,FKBP12.6,PLB,P-PLB)及线粒体代谢相关蛋白(TFAM,NRF-1,Drp-1,mfn1)表达情况。利用膜片钳技术测定左心房心肌细胞L型钙电流并利用共聚焦显微镜测定细胞内钙瞬变。为进一步研究钙信号通路上游的调控机制,通过免疫组化,western blot及PCR观察心房组织CaMKII及p-CaMKII蛋白及mRNA表达情况。培养小鼠心房肌细胞系HL-1细胞,将细胞随机分为4组:对照组,血管紧张素II(AngII)刺激组,别嘌呤醇预处理(10μM)+AngII刺激组,别嘌呤醇预处理(100μM)+AngII刺激组。通过检测HL-1细胞中ROS生成及MnSOD等蛋白表达测定各组HL-1细胞氧化应激水平,测定各组细胞CaMKII及p-CaMKII蛋白表达水平。结果超声检查及病理学研究发现,与对照组相比,糖尿病组动物左心室肥厚及心房间质纤维化程度增加,发生明显心脏结构重构。在电生理研究中,糖尿病组动物心房间传导时间及房室传导周期延长,房颤诱发率明显升高,发生明显心脏电重构。糖尿病组兔血清氧化应激指标,包括黄嘌呤氧化酶(XO)、一氧化氮(NO)及丙二醛(MDA)水平明显升高。另外,通过western blot检测蛋白表达发现,氧化应激、纤维化相关蛋白,包括XO,Mn-SOD,NF-κB,TGF-β,P-p38,P-JNK,ERK,P-ERK及线粒体合成代谢相关蛋白,包括TFAM,NRF-1,Drp-1,mfn1在糖尿病心房组织中表达水平均明显升高,应用别嘌呤醇干预可抑制心房结构重构及电重构,降低氧化应激、纤维化蛋白及线粒体合成相关蛋白表达。此外,糖尿病动物心房组织中钙通道蛋白如Cav_(1.2),NCX表达增加,L型钙电流密度及细胞内钙瞬变幅度均增大,提示糖尿病动物心房细胞内钙离子调控异常,应用别嘌呤醇干预后可改善钙离子通道重构。免疫组化及western blot显示糖尿病组动物心房组织CaMKII及p-CaMKII表达增加,应用别嘌呤醇干预后可降低其表达水平。另外,应用AngII刺激HL-1细胞后ROS生成及MnSOD表达水平有所上调,且CaMKII及p-CaMKII蛋白表达有一定程度升高,给别嘌呤醇干预后可在一定程度降低其水平。结论别嘌呤醇作为一种抗氧化剂,可通过抑制黄嘌呤氧化酶活性,减少体内活性氧的生成,抑制CaMKII活性,从而改善糖尿病兔心房结构重构及电重构,抑制细胞内钙离子调控异常,并改善线粒体代谢异常。因此,别嘌呤醇有可能成为糖尿病相关房颤的一种上游治疗方法。关于别嘌呤醇对房颤的治疗作用尚需进一步研究。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2;R541.75
【部分图文】：

实验动物分组及实验设计

每个指标测量三次，其最终数值为三次测量结果的平均值。图2.1 分别为三组动物测量过程获取的样图。图 2.1 各组家兔超声心动图图像注：A:对照组；B：糖尿病组；C:别嘌呤醇组。2.1.3.2 大鼠心脏超声检查糖尿病大鼠模型建立并入组喂养 6 周后，模型建立周期完成，从每组大鼠中随机选取 10 只用于心脏超声学检查。将大鼠放置于气体麻醉箱中进行气体麻醉后，将大鼠仰卧位固定在气体麻醉台，胸前及四肢剃毛。以小动物超声仪涂抹偶联剂，将探头置于大鼠胸前不同位置进行记录测量。采集切面包括心尖四腔、左心室长轴、心尖两腔及心尖长轴等。所有超声测值均取 3 个心动周期的平均值。超声测量的指标包括：二尖瓣环舒张早期运动速度，二尖瓣环舒张晚期运动速度，舒张期室间隔厚度，收缩期室间隔厚度，左心房直径，舒张期左心室内径，收缩期左心室内径，舒张期左室后壁厚度，收缩期左室后壁厚度，射血分数，短轴缩短率等。

19注：*：与对照组相比，p<0.05；#：与 DM 组相比，p<0.05。图 2.2 兔电生理不同位置心电图及房颤诱发率注：A：不同部位电图：高位右房，高位左房，低位左房及右室；B：给兔心房加以 burst 刺激后诱发 AF；C：三组兔 AF 诱发率。2.2.2.2 大鼠电生理研究结果电生理研究显示，三组动物窦性周长（SLC）、右心房有效不应期（RAERP）、左心房有效不应期（LAERP）、房间传导时间（IACT）、右心房心室传导时间（RAVCT）、左心房心室传导时间（LAVCT）都没有明显差异。AF 诱发率在 DM 组明显增加，ALLO 组与 DM 组相比有所下降，但未发现统计学差异。对三组动物心电图进行分析发现，DM 组和 ALLO组心率（HR）明显减慢，RR 间期延长。其他心电图指标，包括 PR、P
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本文编号：2880257