PDGFR-β信号通路调控心肌细胞增殖及心脏再生机制研究

发布时间：2020-11-15 22:43

　　 研究背景:急性心梗可导致心肌细胞在短时间内缺血坏死,并引起心脏功能减退以及心力衰竭的发生。促进原位心肌细胞增殖再生以代替丢失心肌细胞为目标的再生医学一直以来都是医学界研究热点。新生小鼠心尖切除后能够完全再生,但是这种再生能力在出生后7天就会丢失。PDGFR-β作为一种酪氨酸酶受体,能够将细胞外的信号传导到细胞内并启动增殖、代谢、迁移等生物过程。PDGF信号通路的缺失会导致室间隔缺损、晚期胚胎心室发育扩张、冠状动脉血管平滑肌细胞发育障碍、心室致密化不全等心脏畸形;但是对于PDGF信号通路在哺乳动物心脏再生中作用的研究甚少。研究结果:一、PDGFR-β信号通路在促进小鼠心肌细胞增殖及心脏再生中发挥了关键作用1.为了分析PDGFR-β信号通路是否与小鼠出生后心肌再生能力丢失存在联系,我们分离不同年龄(1天、4天、7天、14天、28天及56天)小鼠心肌细胞,提取蛋白进行Western Blot定量检测;发现随着年龄的增长,PDGFR-β在心肌组织中的表达逐渐下降,其磷酸化水平也相应降低。为了探讨PDGFR-β信号与心肌再生的相关性,我们构建1天龄小鼠心尖切除模型,发现新生小鼠心肌损伤后7天心肌组织中PDGFR-β蛋白表达水平和磷酸化水平均明显升高。如上结果提示,PDGFR-β信号通路在新生小鼠心肌再生过程中可能发挥了重要作用。2.为了探究PDGFR-β信号通路在心肌再生中的作用,我们将PDGFR-βD849V/fl小鼠与Myh6-Mercre Mer小鼠杂交,构建了Tamoxifen诱导型心肌细胞特异性PDGFR-β持续磷酸化激活的小鼠(简称为:β-D849V)。7天龄(小鼠心肌组织再生能力丢失的时间点)β-D849V小鼠冠脉前降支结扎构建心梗模型,心梗后21天超声检测心功能发现:相较野生型C57小鼠心梗而言,β-D849V小鼠有更好的心功能(EF值存在显著性差异),Masson染色进一步提示β-D849V小鼠能够有效减小心梗纤维化病灶面积。与野生型小鼠相比,β-D849V小鼠心梗后7天的心肌组织切片中α-actinin与Ki67、p H3、Ed U等多种心肌细胞增殖指标共染细胞比例显著增加。由此证明,特异性激活新生小鼠心肌细胞中的PDGFR-β信号通路能够诱导心梗区心肌细胞增殖,促进心肌组织再生,改善心功能。二、PDGFR-β信号通路通过促进EZH2表达水平调控小鼠心肌细胞增殖及心肌再生1.我们分离1天龄PDGFR-βD849V/fl小鼠原代心肌细胞,体外培养后利用Ad-CMV-Cre病毒感染细胞持续激活PDGFR-β信号通路表达。病毒感染48h后,PDGFR-β信号通路激活组(Ad-CMV-Cre)细胞α-actinin与Ki67、p H3、Ed U等多种增殖指标共染细胞比例显著高于对照组(Ad-CMV-Null);体外实验进一步确认PDGFR-β信号通路能够促进心肌细胞增殖。为了揭示PDGF信号促进心肌再生的分子机制,我们将PDGFR-β信号通路激活组及对照组的心肌细胞进行了RNA测序(RNA-Seq);经生物信息学分析发现,蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶(Enhancer of zeste homolog 2,EZH2)的表达水平在PDGFR-β信号通路激活组的心肌细胞中显著升高,q RT-PCR实验也验证了这一结果。如上实验提示,PDGFR-β信号通路可能通过促进EZH2表达水平参与心肌细胞增殖能力的调节。2.为了确定EZH2与心肌再生是否存在关联,我们构建了1天龄小鼠心尖切除损伤再生模型,术后7天取材检测EZH2表达水平,发现在心肌再生过程中EZH2的表达水平会显著上调;如上结果提示EZH2可能与心肌再生相关。为了确定EZH2在小鼠心肌再生中的作用,我们将EZH2fl/fl小鼠与Myh6-Mercre Mer小鼠杂交,构建EHZ2心肌特异性敲除小鼠(EZH2-c KO);手术制作1天龄小鼠心尖切除模型,术后心脏取材免疫荧光检测心肌损伤后再生过程中心肌细胞的增殖情况(术后7天)和超声心动图检测及Masson染色检测心肌组织再生情况(术后21天)。结果提示,EZH2心肌细胞特异性敲除后导致心肌细胞增殖能力显著下降(Ki67、p H3、Ed U阳性的心肌细胞减少),原本可以完全再生的1天龄小鼠心肌组织发生纤维化,术后21天心功能变差。由此证实,EZH2在新生小鼠心肌再生过程中发挥了关键作用。3.为了证明PDGFR-β信号通路促进心肌细胞增殖与心肌再生是通过调控EZH2来实现的。我们把EZH2c KO小鼠β-D849V小鼠杂交,构建心肌细胞特异性过表达PDGFR-β信号、同时在心肌细胞中特异性敲除EZH2的小鼠(β-D849V;Ezh2c KO)。7天龄β-D849V;Ezh2c KO小鼠构建心梗模型,术后用免疫荧光、Masson染色、心脏超声的技术分析其心肌再生能力,结果表明:EZH2敲除会导致PDGFR-β促进心肌再生的能力丢失。由此证实,PDGFR-β信号通路促进心肌细胞增殖及心肌组织再生是通过上调EZH2表达来实现的。4.为了探究PDGFR-β促进EZH2表达水平的分子机制,我们分离1天龄PDGFR-βD849V/fl小鼠原代心肌细胞,Ad-CMV-CRE腺病毒感染表达Cre酶激活PDGFR-β信号通路,48h后Western-Blot检测PDGF相关下游靶通路,包括:MAPK/Erk、PI3K/Akt、PLCγ等表达与磷酸化水平。结果表明,PDGFR-β信号持续激活可触发P-Akt磷酸化。P-Akt抑制剂(LY294002)处理PDGFR-β信号通路激活的心肌细胞(Ad-CMV-CRE感染)会导致EZH2的表达水平无法上调,且心肌细胞增殖能力被显著抑制。由此证实,激活的PDGFR-β是通过Akt/PI3K信号通路促进EZH2表达进而影响心肌细胞增殖。5.为了阐明EZH2促进心肌细胞增殖的分子机制,我们分别用H3K27me3(EZH2发挥作用的靶蛋白)和SUZ12(EZH2发挥作用的蛋白复合体PRC2成员之一)的抗体开展Ch IP实验,捕获受到PRC2-H3K27me3调控的靶基因Ink4a/Arf,进行q RT-PCR检测。结果表明,EZH2敲除后H3K27me3对Ink4a/Arf转录抑制调控显著下降,上调表达的Ink4a/Arf作为细胞增殖抑制因子,最终导致心肌细胞增殖能力减弱。由此证实,EZH2催化H3K27me3修饰,从而抑制Ink4a/Arf转录最终促进心肌再生。结论:通过如上实验,我们获得了如下结论:1)证实了PDGFR-β信号通路在心肌细胞增殖与心肌组织再生中发挥了关键作用;2)通过RNA测序技术检测出EZH2介导了PDGFR-β信号通路调控心肌细胞增殖的过程,并证实EZH2是心脏再生能力维持的关键分子;3)PDGFR-β信号通路调节心肌细胞中AKT/PI3K的磷酸化,促进EZH2表达;EZH2作为PRC2蛋白复合体成员催化H3K27me3修饰,抑制细胞周期阻遏分子Ink4a/Arf上调,实现了对心肌细胞增殖和心肌组织再生能力的调控。这一研究,为解析哺乳动物心肌再生分子机制提供了新的科学依据;为心肌再生干预手段开发提供了新的潜在靶点。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R541
【部分图文】：

结果一、检测不同年龄段小鼠心肌组织PDGFR-β通路表达。有研究表明，1 天龄的乳鼠心肌损伤后 21 天能够完全增殖再生，但这种能力在出生后 7 天丢失，损伤的心肌细胞不能完全再生。为了分析 PDGFR-β 信号通路是否与小鼠出生后心肌再生能力丢失存在联系，我们分离不同年龄（1 天、4 天、7 天、14 天、28 天及 56 天）小鼠心肌组织，提取蛋白后进行 Western Blot 定量检测 PDGFR-β信号通路表达改变；结果显示：随着年龄的增长，PDGFR-β 在心肌组织中的表达逐渐下降，其磷酸化水平发生显著降低，在 7-14 天年龄这个时间点尤为明显（图 1 A，B），而这个下降的时间点恰好与心脏再生能力丢失时间点相一致。已有研究证实，随着年龄的增长，胰腺细胞增殖能力下降与 PDGF 受体的表达降低存在联系。据此，我们推测心肌再生能力丢失可能与 PDGFR-β 表达下降相关。

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文为了探究 PDGF 信号通路是否参与到新生小鼠心肌损伤再生过程中，我们对 1天龄小鼠构建心尖切除模型后的心尖部分组织样本进行了 Western-Blot 检测PDGFR-β 信号通路表达改变，发现新生小鼠心肌损伤后 7 天心肌组织中 PDGFR-β 表达水平明显上调，磷酸化水平明显升高（图 2 A，B）。为了进一步证实 PDGFR-β 在心肌组织中激活，我们利用 RNA 原位杂交（RNAscope ）技术在心肌切片组织中检测Pdgfr-β基因表达情况。结果显示，在心肌组织中新生小鼠心尖切除术后4天Pdgfr-βmRNA 转录水平明显高于假手术组，在切口位置尤其明显（图 2 D）。免疫组化染色（IHC）结果表明，心肌组织中心肌细胞磷酸化 PDGFR-β 表达水平相比于假手术组心肌组织中明显升高（图 2C）。因此，我们证实 PDGFR-β 信号通路在新生小鼠心尖切除后再生过程中的心肌细胞中存在激活现象。二、新生小鼠心肌细胞损伤后PDGFR-β通路表达升高

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文为了探究 PDGF 信号通路是否参与到新生小鼠心肌损伤再生过程中，我们对 1天龄小鼠构建心尖切除模型后的心尖部分组织样本进行了 Western-Blot 检测PDGFR-β 信号通路表达改变，发现新生小鼠心肌损伤后 7 天心肌组织中 PDGFR-β 表达水平明显上调，磷酸化水平明显升高（图 2 A，B）。为了进一步证实 PDGFR-β 在心肌组织中激活，我们利用 RNA 原位杂交（RNAscope ）技术在心肌切片组织中检测Pdgfr-β基因表达情况。结果显示，在心肌组织中新生小鼠心尖切除术后4天Pdgfr-βmRNA 转录水平明显高于假手术组，在切口位置尤其明显（图 2 D）。免疫组化染色（IHC）结果表明，心肌组织中心肌细胞磷酸化 PDGFR-β 表达水平相比于假手术组心肌组织中明显升高（图 2C）。因此，我们证实 PDGFR-β 信号通路在新生小鼠心尖切除后再生过程中的心肌细胞中存在激活现象。二、新生小鼠心肌细胞损伤后PDGFR-β通路表达升高
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本文编号：2885296