卵泡抑素样蛋白1对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用及其机制的研究

发布时间：2020-12-24 07:29

　　目的:近年来研究者对卵泡抑素样蛋白1（FSTL1）的心脏保护作用进行了广泛的研究,但其在心肌缺血再灌注损伤中的作用尚未完全明确,机制也不清楚。本实验中,我们系统研究FSTL1预处理对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用,并进一步对机制进行了探讨,研究自噬通路在这一过程中的作用。方法:第一部分首先研究体外缺血再灌注损伤模型中心肌细胞的自噬变化（p62、Beclin-1和LC3II/I蛋白表达变化）,再使用自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA进行自噬干预,并检测干预后心肌损伤情况（CCK-8检测细胞活性、EDU检测细胞增殖能力、流式Annexin V/PI检测凋亡）,明确自噬在心肌细胞缺血再灌注损伤中的作用;第二部分实验中采用FSTL1预处理心肌细胞,再行缺血再灌注处理,检测心肌损伤标志物CK-MB水平变化,同时CCK-8、EDU和AnnexinV/PI分别检测FSTL1对缺血再灌注损伤心肌细胞活性、增殖和凋亡的影响;第三部分研究FSTL1预处理对于缺血再灌注损伤心肌细胞自噬（p62、Beclin-1、LC3 11/1蛋白表达以及mRFP-GFP-LC3检测自噬流）的作用;并在FSTL1预处... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：99 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图１－１?Ａ－Ｃ?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ检测大鼠心肌细胞Ｈ９Ｃ２在缺血缺氧再灌注前后，自噬??相关主要蛋白的变化

正文第一部分结果??Ｉ的相对表达量也明显上调。说明缺血缺氧再灌注后，新生鼠未成熟原代心肌细胞??的自噬水平显著提高。（图１－２）??Ａ?Ｂ?Ｃ??＾?■?Ｃｏｎｔｒｏｌ?■?Ｃｏｎｔｒｏｌ??〇步?Ｏ?Ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ?Ｅ３?Ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ??１?２＇５ｉ?ｎ?．?３ｌ＾??＆?２．０－?ｒｉ?ｏ??ｐ６２?６２?ｋＤａ?｜?ｇ－?２－??＾?＊＊?圍?？孬［３??Ｂｅｃｌｉｎ－１?６〇?ｋＤａ?５?１分?＿?．?〇．?—??匕３?１二二誦３?ｊ?０５－?Ｉ?ｎ?Ｉ?§〇?＇?■??ＬＣ３?ＩＩ?１４?ｋＤａ?＾?〇?〇Ｊ．．．．．ＭＭ■■■＂．■—＿」■■■?｜?〇＿?Ｍ??Ｐａｃｔｉｎ?ｉ｜０ＭＰ?４３?ｋＤａ?＾?＾?？?々??°〇?＾??Ｉｍｍａｔｕｒｅ?ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ??图１－２?Ａ－Ｃ?Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测未成熟心肌细胞在缺血缺氧再灌注前后，自噬相关??主要蛋白的变化。Ｍ／＾Ｏ．Ｏｌｖｓｃｏｎｔｒｏｌ组??３．３雷帕霉素和３－ＭＡ干预在Ｈ９Ｃ２细胞ＩＲＩ中的作用??上述的实验证实：心肌细胞在ＩＲ１后自噬明显增强，为进一步明确自噬对于心??肌细胞的作用，我们使用自噬增强剂（雷帕霉素）和自噬抑制剂（３－ＭＡ）进行干??预，分别使用１００ｎＭ雷帕霉素或５ｍＭ３－ＭＡ预处理６ｈ后，再进行Ｉ／Ｒ处理。??３．３．１?ＣＣＫ８检测Ｈ９Ｃ２细胞活性??用自噬抑制剂３－ＭＡ和自噬诱导剂雷帕霉素预处理Ｈ９Ｃ２细胞６ｈ后，再进行??Ｉ／Ｒ处理，检测处理前后细胞活性变化。利用ＣＣＫ－８检测试剂盒来检测细胞活性，??该试剂中含有ＷＳＴ－８

?正文第？部分结果??胞活性显著升高。（图１－３）??１２５－．??ｔ?１００－?—：￣｜?＃??咖ｈ??Ｃｏｎｔｒｏｌ?０?Ｒａｐａ?３－ＭＡ??Ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ?２４ｈ??图１－３?ＣＣＫ－８检测不同条件下细胞活性的变化。０组：未给予药物干预的ＩＲＩ??组。＊Ｐ＜０．０５雷帕霉素ｖｓＯ组；＃尸＜０．０５?３－＾１八组ｖｓＯ组。??３．３．２?ＥＤＵ检测Ｈ９Ｃ２细胞的增殖情况??同样用自噬抑制剂３－ＭＡ和自噬诱导剂雷帕霉素预处理Ｈ９Ｃ２细胞６ｈ，再次??缺血缺氧再灌注后，细胞增殖变化。我们采用了?ＥＤＵ试剂盒来检测细胞增殖能力，??因ＥｄＵ是一种胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶核苷酸渗入正??在复制的ＤＮＡ分子，因此通过检测ＥｄＵ标记能准确地反映细胞的增殖情况。结??果：与缺血缺氧再灌注组比较，自噬抑制剂组细胞增殖显著降低；与缺血缺氧再??灌注组比较，自噬诱导剂组细胞增殖显著升高。（图］－４）??１９??


本文编号：2935246