溶酶体功能障碍在心肌细胞缺血缺氧损伤中的作用及其机制研究

发布时间：2021-07-12 06:16

　　研究背景缺血缺氧是心肌最常见的损害因素之一,严重烧伤患者早期,心肌也存在缺血缺氧损害。缺血缺氧可调控心肌细胞自噬水平,但自噬对心肌损害的作用一直备受争议。目前认为自噬-溶酶体通路（autophagic-lysosomal pathway,ALP）障碍导致的自噬流受损是介导细胞损伤的重要因素。但自噬流受损介导细胞损伤的具体机制尚不清楚。自噬流受损可表现为自噬底物堆积,溶酶体体积增大,使溶酶体更易受到外界因素的损害。溶酶体膜损伤主要表现为溶酶体膜通透化（lysosomal membrane permeabilization,LMP）,伴随溶酶体内容物包括质子及多种水解酶的漏出,导致胞浆酸化,介导凋亡、坏死等多种细胞死亡。既往研究提示,心肌缺血导致溶酶体水解酶分布异常及活性改变。但心肌缺血损伤中是否发生LMP缺乏确切证据,LMP对心肌细胞损伤的调控尚不清楚。溶酶体功能障碍是导致自噬流受损的重要机制,也是多种疾病的重要致病因素。近年来发现,在异丙肾上腺素注射构建的心肌梗死模型中也存在溶酶体功能障碍。调控溶酶体功能的分子包括溶酶体水解酶、溶酶体膜相关蛋白以及参与溶酶体成分分选、运输及翻译后修饰的... 

【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市

【文章页数】：119 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

AO释放实验检测缺血缺氧对心肌细胞LMP的影响

陆军军医大学博士学位论文31图2.2Gal3免疫荧光染色检测缺血缺氧对心肌细胞LMP的影响A.常氧组及缺血缺氧组心肌细胞Gal3和Lamp1免疫荧光染色；B.图A中单位面积Gal3荧光强度的统计检验结果，―*‖代表相对于常氧组p<0.05。溶酶体膜损伤可导致溶酶体水解酶漏出至胞浆中裂解胞浆中的重要分子，引起细胞损伤甚至细胞死亡。CatB及CatD（cathepsinD）是溶酶体内重要的组织蛋白酶，也是与溶酶体相关的细胞死亡关系最为密切的两种水解酶。因此，接下来我们采用digitonin提取不含溶酶体成分的胞浆成分，通过检测胞浆中CatB的活性反映溶酶体水解酶向胞浆漏出的情况[62,63]。依据文献报道，我们采用不同浓度（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、200ug/ml）digitonin溶液提取胞浆成分，检测胞浆CatB的活性及LDH水平，判断提取不含溶酶体的胞浆成分的最佳digitonin浓度。我们发现digitonin溶液浓度在15-20ug/ml之间时，LDH基本达到最大水平（图2.3），此时细胞膜完全通透，但溶酶体膜尚未被破坏。结合文献报道，我们选取的digitonin浓度为17ug/ml。

陆军军医大学博士学位论文32图2.3digitonin最佳浓度筛选用17ug/mldigitonin提取不含溶酶体的胞浆成分，检测胞浆中CatB的活性。实验分为对照组、缺血缺氧处理3h、6h、9h组。我们发现，心肌细胞缺血缺氧处理3h，胞浆中CatB活性显著增强，随着处理时间的延长，胞浆中CatB活性逐渐增高（图2.4）。上述3种方法共同说明，缺血缺氧引起心肌细胞LMP，导致溶酶体内水解酶漏出至胞浆中。由于CatB在胞浆中性环境仍具有活性，因此LMP可能是介导缺血缺氧心肌细胞损伤的重要因素。图2.4digitonin提取法检测胞浆中CatB活性常氧组及缺血缺氧3h、6h、9h组胞浆CatB活性检测统计结果，―**‖代表相对于常氧组p<0.01。


本文编号：3279381