组织因子靶向性纳米粒介导siRNA的靶向递送

发布时间：2021-08-08 07:08

　　组织因子（TF）作为凝血途径的始动因子以为人所熟知。在血管损伤后,TF和凝血因子Ⅶa （FVIIa）形成复合物激活凝血蛋白酶的瀑布反应,导致纤维蛋白沉积和血小板的活化。另外,在许多疾病如败血症,动脉粥样硬化和肿瘤,血管中TF的异常表达会引起致命的血栓形成。近年来研究表明,血管中的TF在产生凝血蛋白酶和后续激活蛋白酶激活受体（PARS）中也发挥着非止血作用。这些TF依赖性的信号通路促进了一系列生物进程,包括炎症,肿瘤转移和细胞迁移。本课题组前期研究的EGFP-EGF1蛋白具有TF特异性和高度的亲和力,且将其连接于聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒（PLGA）纳米粒表面后构建的EGFP-EGF1-PLGA纳米粒也具有TF靶向性。小干扰RNAs （siRNA）通过完全互补的RNA诱导沉默复合体（RISC）介导特异性切割,并有针对性的破坏靶基因的mRNA,从而产生靶基因的mRNA序列特异基因沉默效应。它们己被证明能有效下调人类细胞中的基因表达,从而具有治疗疾病的潜力。然而,siRNA分子本身带负电荷,易于被血清中的核酸酶降解,容易被肾脏清除,并无靶向分布能力,这些都导致它难以到达作用的靶细胞。... 

【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：138 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 载组织因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒的构建及表征
    1 仪器和材料
        1.1 仪器
        1.2 材料和试剂
    2 实验方法
        2.1 大鼠TF-siRNA片段的筛选
        2.2 载TF-siRNA的PEG-PLGA纳米粒的制备
        2.3 EGFP-EGF1结合PEG-PLGA纳米粒
        2.4 TF-siRNA-EGFP-EGF1-PLGA纳米粒的表征
        2.5 ENP和NP载siRNA的载药量和体外释放
    3 实验结果
        3.1 TF-siRNA的筛选
        3.2 载TF-siRNA的NP和ENP的表征
        3.3 TF-siRNA-ENP的免疫电镜
        3.4 TF-siRNA-ENP的EGFP-EGF1蛋白连接效率
        3.5 载TF-siRNA纳米粒的载药量及包封率
        3.6 TF-siRNA-ENP的体外释放
    4 讨论
第二部分 载组织因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒的靶向性及体外评价
    1 仪器和材料
        1.1 仪器
        1.2 材料和试剂
        1.3 实验动物
    2 实验方法
        2.1 大鼠BMECs原代细胞培养鉴定及体外损伤模型的建立和鉴定
        2.2 载TF-siRNA和香豆素-6的ENP和NP的制备
        2.3 香豆素-6体外HPLC分析方法的建立
        2.4 比浊法测定载香豆素-6纳米粒的浓度
        2.5 香豆素-6的载药量和包封率
        2.6 大鼠BMECs对载siRNA和香豆素-6的ENP的摄取及siRNA的示踪
        2.7 TF-siRNA-ENP对BMECs的毒性评价
        2.8 TF-siRNA-ENP对损伤BMECs的TF mRNA的影响
        2.9 TF-siRNA-ENP对损伤BMECs的TF蛋白表达的影响
        2.10 TF-siRNA-ENP对损伤BMECs表达TF活性的影响
    3 实验结果
        3.1 大鼠BMECs原代细胞免疫荧光鉴定
        3.2 香豆素-6体外HPLC分析方法的建立
        3.3 香豆素-6的载药量和包封率
        3.4 大鼠BMECs对载siRNA和香豆素-6的ENP和NP的摄取和siRNA的示踪
        3.5 TF-siRNA-ENP的体外毒性评价
        3.6 TF-siRNA-ENP对损伤BMECs表达TF mRNA的影响
        3.7 TF-siRNA-ENP对损伤BMECs的TF蛋白表达的影响
        3.8 TF-siRNA-ENP对损伤BMECs表达TF活性的影响
    4 讨论
第三部分 EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒在动脉粥样硬化模型中靶向性的研究
    1 仪器和材料
        1.1 仪器
        1.2 材料和试剂
        1.3 实验动物
    2 实验方法
        2.1 小鼠VSMCs的原代培养和鉴定
        2.2 高表达TF的细胞模型的建立及鉴定
        2.3 载Dir纳米粒的合成和鉴定
        2.4 载香豆素-6纳米粒的细胞摄取
        2.5 小鼠AS模型的建立和鉴定
        2.6 Dir-ENP在AS模型小鼠体内组织分布
    3 实验结果
        3.1 小鼠原代VSMCs的鉴定
        3.2 体外高表达TF细胞模型的鉴定
        3.3 Dir载药量的测定
        3.4 载香豆素-6纳米粒的细胞摄取
        3.5 小鼠AS模型的鉴定
        3.6 Dir-ENP在AS模型小鼠体内组织分布
    4 讨论
第四部分 载CCR2-shRNA的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒的体外研究
    1 仪器和材料
        1.1 仪器
        1.2 材料和试剂
        1.3 实验动物
    2 实验方法
        2.1 AS模型小鼠主动脉中TF和CCR2表达的鉴定
        2.2 体外表达TF和CCR2细胞模型的建立及鉴定
        2.3 CCR2-shRNA的质粒提取
        2.4 载CCR2-shRNA纳米粒的制备
        2.5 CCR2-shRNA-ENP的体外毒性研究
        2.6 CCR2-shRNA-ENP对细胞模型CCR2表达的影响
        2.7 CCR2-shRNA-ENP对细胞迁移能力的影响
    3 实验结果
        3.1 AS模型小鼠主动脉中TF和CCR2表达的鉴定
        3.2 体外表达TF和CCR2细胞模型的鉴定
        3.3 CCR2-shRNA-ENP的体外毒性
        3.4 CCR2-shRNA-ENP对细胞模型CCR2表达的影响
        3.5 CCR2-shRNA-ENP对细胞迁移的影响
    4 讨论
参考文献
全文总结
综述
    参考文献
英文缩写对照
致谢
附录一 攻读学位期间发表论文目录
附录二 攻读学位期间参与课题和会议


【参考文献】：
期刊论文
[1]大鼠凝血因子Ⅶ EGFP-EGF1融合蛋白的表达及其结合功能初步研究[J]. 梅恒,胡豫,张迎红,王华芳,方峻,郭涛,魏文宁.  中国实验血液学杂志. 2008(01)



本文编号：3329482