锌指蛋白转录活化因子治疗下肢缺血及对骨骼肌肌纤维重塑的研究

发布时间：2021-10-13 13:04

　　第一部分体外制备锌指蛋白转录活化因子目的：合成与血管内皮生长因子（VEGF）的启动子结合的锌指蛋白转录活化因子（ZFP-ATF）.方法：利用锌指蛋白（ZFP）软件工具根据VEGF启动子序列合成ZFP结合区,通过基因克隆实验将合成的ZFP结合区及P65激活区的目的基因克隆到PVAX1质粒中,采用双酶切及DNA测序方法进行目的基因检测。结果：ZFP软件合成的ZFP含有6个锌指基序,酶切方法证实克隆构建的位点在BamHl和Xholl间。测序的目的基因的长度是1100bP,PVAX1是3.0KB。结论：成功合成了PVAX1-ZFP-P65质粒；ZFP-ATF结构包括DNA的特异性结合区及转录激活区,可以特异性的与VEGF启动子结合并激活内源性VEGF基因表达。第二部分体外细胞实验检测ZFP-ATF对VEGF的作用目的：在体外细胞水平检测ZFP-ATF对VEGF基因的作用。方法：通过细胞转染的方法将ZFP-ATF、VEGF165转染入Hy926细胞内,之后检测VEGF剪接体形式及蛋白的相对表达浓度。结果：ZFP-ATF主要促进VEGF的主要三种剪接体形式的产生,同时VEGF的蛋白相对浓度要显著高... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：125 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
    参考文献
第一部分 锌指蛋白转录活化因子的制备
    引言
    一 材料与仪器
    二 实验方法
        (一) 人工合成锌指蛋白目的基因和靶基因的结构合成
        (二) 基因克隆
            1. 聚合酶链反应(PCR)实验
            2. PCR产物回收
            3. 质粒与合成的锌指蛋白目的DNA片段的连接
            4. 大肠杆菌感受态细胞的制备
            5. 转化与筛选
            6. 取PCR阳性的LB菌液进行保菌
            7. 质粒提取：取PCR阳性的LB管进行小质粒提取
            8. 酶切鉴定质粒中的插入片断
        (三) 将PVAX1-ZFP质粒与PcDNA3.0-P65质粒进行重组构成PVAX1-ZFP-P65质粒
    三 实验结果
        1 合成锌指蛋白的氨基酸序列
        2 合成锌指蛋白的结构组成
        3 质粒的酶切电泳图
    四 讨论
        一 锌指蛋白的转录作用
        二 人工合成锌指蛋白转录因子
        三 VEGF基因作用
    参考文献
第二部分 ZFP-ATF在细胞实验中的研究
    引言
    一 实验材料及试剂
    二 实验方法
        1. Hy926细胞株的培养
            1.1 细胞复苏
            1.2 细胞传代
        2. 质粒转染入Hy926细胞内
        3 细胞总RNA提取(TkIzol法)
        4 RT-PCR检测VEGF不同剪接体基因的表达
        5 细胞内蛋白提取
        6 蛋白浓度测定和Western-Blotting
    三 实验结果
        1 细胞形态
        2 R-T PCR结果
        3 Western Blot结果
    四 讨论
        一 VEGF基因的信号传导
        二 VEGF基因的不同剪接体的生成及作用
    参考文献
第三部分 大鼠肠系膜血管实验
    引言
    一 实验材料
    二 实验步骤
        (一) SD大鼠的饲养
        (二) 大鼠肠系膜血管增生实验
        (三) 大鼠肠系膜免疫荧光实验
    三 实验结果
        (一) 肠系膜血管计数
        (二) 肠系膜免疫荧光实验结果
    四 讨论
        一 肠系膜血管床的特点
        二 血管的渗透性研究
        三 ZFP-ATF促进血管稳定性的研究
    参考文献
第四部分 在构建小鼠缺血模型后PLGA优化载体以及ZFP-ATF在小鼠下肢缺血中的治疗性血管生成作用及对骨骼肌肌纤维类型研究
    引言
    一 实验材料
    二 实验方法
        (一) 小鼠下肢缺血模型建立
        (二) PLGA纳米粒子优化载体的构建
        (三) 实验小鼠的分组及治疗
        (四) 小鼠缺血侧肌肉标本的处理
            1, 小鼠骨骼肌肌肉重量的检测
            2, Western Blot实验
            3, 染色组织学形态观察,免疫组化
            4 在注入质粒后的7,14天分别对小鼠缺血下肢进行评分
        (五) 骨骼肌肌纤维类型研究
            1, 组织RNA提取和Real-time PCR
            2, 冰冻切片行肌纤维ATP酶染色
    三 实验结果
        (一) 小鼠缺血模型构建结果
        (二) PLGA纳米优化载体的构建
        (三) 下肢肌肉的重量测量
        (四) Western Blot实验结果
        (五) 肌肉组织化学染色
        (六) 下肢缺血肢体的功能评估
        (七) MHC Real-time PCR实验结果
        (八) 骨骼肌肌纤维ATP酶染色
    四 讨论
        一 缺血后的血管生成
            1.1 缺血后VEGF表达限制性
            1.2 ZFP-ATF在缺血治疗中的优势
        二 肌纤维的研究
            2.1 骨骼肌肌纤维分类及功能
            2.2 缺血后骨骼肌肌纤维转变
            2.3 基因治疗后骨骼肌肌纤维的转变
    参考文献
综述
    参考文献
个人情况
发表文章
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]转染VEGF165基因的自体成肌细胞治疗心肌梗死的实验研究[J]. 庄炜,李莉,章庆春,林国强,邓震宇.  中南大学学报(医学版). 2012(07)
[2]The C2H2 -type Zinc Finger Protein ZFP182 is Involved in Abscisic Acid-Induced Antioxidant Defense in Rice[J]. Hong Zhang 1,2 , Lan Ni 1,2 , Yanpei Liu 1,2 , Yunfei Wang 1,2 , Aying Zhang 1,2 , Mingpu Tan 1,2 and Mingyi Jiang 1,2 1 College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China 2 National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China.  Journal of Integrative Plant Biology. 2012(07)
[3]水稻C2H2型锌指蛋白基因RZF71的克隆与表达分析[J]. 郭书巧,黄骥,江燕,张红生.  遗传. 2007(05)
[4]血管内皮生长因子抗体靶向血管治疗对增生性瘢痕Ⅰ型胶原蛋白表达的影响[J]. 岳毅刚,蒋常文,李佩英,周思.  中华烧伤杂志. 2006(06)
[5]VEGF启动子介导双自杀基因重组腺病毒对LoVo细胞的体外杀伤作用[J]. 黄宗海,陈建雄,苏国强.  第一军医大学学报. 2005(05)
[6]应用AdEasier-1系统高效制备含VEGFP驱动TK自杀基因的重组腺病毒[J]. 陈建发,黄宗海,黄元媛,宋慧娟,车小燕.  癌症. 2004(09)
[7]下咽癌肿瘤及转移淋巴结中VEGF、PDGF和MVD的表达及意义[J]. 董频,宫鸠义己,中岛格.  临床耳鼻咽喉科杂志. 2002(09)
[8]带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165载体的克隆[J]. 周忠江,刘伊丽,吴平生,李小卫,查道刚,周颖.  第一军医大学学报. 2002(02)



本文编号：3434723