基于诱导多能干细胞技术的短QT综合征模型的建立与药物筛选

发布时间：2021-10-22 18:17

　　研究目的短QT综合征（Short QT syndrome,SQTs）是一种极其罕见,异源基因遗传的心脏离子通道病,该病以心电图上QT间期、心室及心房不应期的明显缩短为主要临床特征,同时可以引起恶性心律失常而导致心源性猝死的发生。SQTs具有家族遗传性,其发病机制尚不明确,在临床上缺少特效药物,严重危害患者健康。现已有6种SQTs亚型被发现,其中1型、2型及3型均与钾离子通道的功能性改变有关。KCNH2（Potassium voltage-gated channel subfamily H member 2）基因是最早被确认的致病基因的突变位点,但还没有较为完整的研究去阐述为何KCNH2突变会引发SQTs,目前仍未发现针对此种位点突变的有效治疗药物。因此,基于之前的研究及文献报道,本课题的研究目的是建立SQTs病人特异性的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PSCs）模型研究疾病的发病机制,并通过i PSCs衍生的心肌细胞进行靶向药物的筛选。研究方法本课题成功入组了1例携带KCNH2 T618I位点突变的SQTs患者以及2例健康受试者,并建立... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：111 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

SQTs病人临床资料。

本课题分别取得了3位受试者的皮肤活检样本,并在取得样本组织后进行了皮肤成纤维细胞的体外培养实验,图2A是由样本培养产生的成纤维细胞。应用非整合仙台病毒介导的方法对皮肤成纤维细胞进行重编程,获得了对照组和病人组的iPSCs,图2B所示是单克隆状态下生长的iPSCs。为了确定所得细胞株是否具有碱性磷酸酶的活性,依次对三组细胞株进行了AP染色,代表结果如图2C所示。最后,使用OCT4、SOX2、NANOG和SSEA-4等多能性标志物进行iPSCs的免疫染色,结果均现阳性(图2D),为了检测iPSCs的干性,选取OCT4和SOX2为检测基因,分别对三组细胞株进行qPCR实验,结果如图2E所示,三组细胞与皮肤成纤维细胞相比,均表现出较强的细胞干性。为了防止病人组的iPSCs在重编程过程中产生其他基因改变,分别对病人组iPSCs的三个克隆进行了核型分析,结果均显示正常(图2F)。为了更为准确和严格的确定疾病表型,对病人组和对照组的iPSCs进行C1853T(T618I)位点的检测,检测结果显示只有病人组iPSCs带有特异位点突变(图2G)。3.3 SQTs校正组i PS细胞株的建立及其鉴定

为了避免对照组和病人组的细胞间存在基因表型的差异,保证更为精准的实验和疾病表型分析,本课题应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在SQTs病人组iPSCs水平上对T618I突变位点进行校正,以WT序列和同源序列(homology arms,HA)为模版(图3A),通过Puromycin筛选和Spe I酶切鉴定,初步获得了12个阳性克隆(图3B、D),再通过后续的PCR实验和特定位点的基因鉴定,获得了3个阳性克隆:Clone#15,Clone#20,Clone#33(图3C-D)。随后,对获得的校正细胞株进行了相关鉴定试验,校正组iPSCs有典型的干细胞形态(图3E)和AP活性(图3F),同时使用多能性标志物染色呈现阳性结果(图3G),最后对特定基因进行qPCR检测干性相关基因活性,结果也与对照组和病人组的检测结果相吻合(图2E)。3.4 心肌细胞的形态学研究


本文编号：3451623