敲低C3G对大鼠梗死后心脏重构的影响及其机制研究
发布时间：2021-11-01 14:35
目的:探讨敲低C3G（Crk SH3域结合鸟嘌呤核苷酸交换因子）对大鼠梗死后心脏重构影响及其机制研究。方法:构建阴性对照（NT CRISPR/Cas9）及C3G CRISPR/Cas9质粒,并分别将其包装成重组慢病毒,筛选有效敲除C3G重组慢病毒。在体实验,结扎冠状动脉左前降支,造大鼠心肌梗死模型。动物实验分为Sham + NT CRISPR/Cas9、Sham + C3G CRISPR/Cas9、MI + NT CRISPR/Cas9 及 MI + C3G CRISPR/Cas9 组。将 NT CRISPR/Cas9 慢病毒及C3G CRISPR/Cas9慢病毒感染H9C2心肌细胞及成纤维细胞,并予以低氧处理建立细胞低氧模型。离体实验分为NT CRISPR/Cas9、C3G CRISPR/Cas9、NT CRISPR/Cas9 低氧和 C3G CRISPR/Cas9 低氧等组。于心梗后1周及12周行多普勒超声检测心脏结构及功能,且于心梗后12周取大鼠心脏并称重,HE染色观察心肌组织学变化,苦味酸天狼星染色检测心肌胶原纤维,RT-PCR及免疫组化检测C3G mRNA及蛋白,Wester...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１重组质粒的测序??Ｆｉｇ．ｌ?Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??
胞密度达７０％时更换新鲜培养基，分别加入空白、ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及３种不同Ｃ３Ｇ??ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９重组慢病毒，培养２４小时后予以更换培养基，当细胞融合度达到??８５％左右时提取蛋白，进行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ检测，结果表明包装成功（图２）。??＾?＾?＾??＾?Ｖ??ｋＤａ?＾?＾??＾７￣?—ＧＡＰＤＨ??１４２－?…－?—ＤＤＫ－Ｃａｓ９??图２包装慢＾病毒的验证??Ｆｉｇ．２?Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐａｃｋａｇｉｎｇ?ｉｎｔｏ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ??１．２．４建立大鼠心肌梗死模型、实验分组及干预??根据Ｌｉｔｗｉｎ方法建立大鼠心肌梗死模型。用１０％的水合氯醛进行腹腔麻醉??（３ｍｌ／ｋｇ）后，将大鼠固定在手术上，备皮，用碘伏消毒并铺巾。在胸骨上缘约ｌｃｍ??处做一纵行小切口，钝性分离皮下筋膜及肌肉，充分暴露气管，于环状软骨下方约??２个气管环处做一横行小切口，充分止血后予以气管插管，连接呼吸机；待大鼠呼??吸与呼吸机同步后，于心脏搏动最明显处做一纵行切口，长约１．５ｃｍ，钝性分离皮??下筋膜及肌肉，剪断一根肋骨，撕开心包，充分暴露心脏，寻找左心耳及其下方的??左冠状动脉，在左心耳下方约ｌｃｍ处结扎左冠状动脉前降支（假手术组只贯穿，不??结扎），观察结扎远端心脏颜色变化，若变成暗紫色提示结扎成功，依据实验分组??于大鼠梗死区（注射３个点
缝合气管切口及皮肤，消毒。尾静脉注射重组慢病毒（５００ｕｌ／周）。??１．２．５细胞实验干预??筛选有效敲除Ｃ３Ｇ的重组慢病毒（图３）。将相同数量的Ｈ９Ｃ２细胞接种于将相??同数量的Ｈ９Ｃ２细胞接种于孔板（２份）中，分别感染ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９和Ｃ３Ｇ??ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９慢病毒，培养４５ｈ。从上述２份孔板中随机取出一份将培养基换成ＰＢＳ??后，置于３７°Ｃ、１％０２、９４％Ｎ２、５％Ｃ０２的低氧孵箱中培养１８ｈ，另一份继续培??养?１８ｈ，此时细胞分为?ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃ３Ｇ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?低??氧和?Ｃ３ＧＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?低氧组。收集细胞，ＲＴ－ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ、ＣＣＫ－８?及流式??细胞术检测。??＾?＾?＾?＾?＾??＾?＾?＾?＾?＾??Ｚ?Ｚ?Ｚ?Ｚ?Ｚ?Ｚ??ｋＤａ?４?Ｃ？＆?＃?Ｃ？。夕?Ｃ？＞＆??３７一?？一鱗？？?ＧＡＰＤＨ??１２１—??图３?Ｃ３Ｇ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９重组慢病毒筛选??Ｆｉｇ．３?Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ?ｏｆ?Ｃ３Ｇ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ??１．２．６超声心动图检测??于心梗后１Ｗ及１２Ｗ，将大鼠腹腔麻醉并备皮，彩色多普勒超声检测心脏射血??分数（ＥＦ％），左室舒张末直径（ＬＶＤｄ）及舒张期左室后壁厚度（ＬＶＰＷｄ）。??１．２．７标本采集和心室质量测定??心梗后１２Ｗ
【参考文献】：
期刊论文
[1]C3G基因对H9C2心肌细胞凋亡和增殖的影响[J]. 杨东艳,李刚,张蕾,张志升,扶艳波,胡苏蕾. 解放军医学杂志. 2015(08)
[2]鸟苷酸交换因子C3G对心肌细胞生存力的影响及其可能机制[J]. 张旭,李刚. 第二军医大学学报. 2012(11)
本文编号：3470282
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１重组质粒的测序??Ｆｉｇ．ｌ?Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??
胞密度达７０％时更换新鲜培养基，分别加入空白、ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及３种不同Ｃ３Ｇ??ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９重组慢病毒，培养２４小时后予以更换培养基，当细胞融合度达到??８５％左右时提取蛋白，进行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ检测，结果表明包装成功（图２）。??＾?＾?＾??＾?Ｖ??ｋＤａ?＾?＾??＾７￣?—ＧＡＰＤＨ??１４２－?…－?—ＤＤＫ－Ｃａｓ９??图２包装慢＾病毒的验证??Ｆｉｇ．２?Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐａｃｋａｇｉｎｇ?ｉｎｔｏ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ??１．２．４建立大鼠心肌梗死模型、实验分组及干预??根据Ｌｉｔｗｉｎ方法建立大鼠心肌梗死模型。用１０％的水合氯醛进行腹腔麻醉??（３ｍｌ／ｋｇ）后，将大鼠固定在手术上，备皮，用碘伏消毒并铺巾。在胸骨上缘约ｌｃｍ??处做一纵行小切口，钝性分离皮下筋膜及肌肉，充分暴露气管，于环状软骨下方约??２个气管环处做一横行小切口，充分止血后予以气管插管，连接呼吸机；待大鼠呼??吸与呼吸机同步后，于心脏搏动最明显处做一纵行切口，长约１．５ｃｍ，钝性分离皮??下筋膜及肌肉，剪断一根肋骨，撕开心包，充分暴露心脏，寻找左心耳及其下方的??左冠状动脉，在左心耳下方约ｌｃｍ处结扎左冠状动脉前降支（假手术组只贯穿，不??结扎），观察结扎远端心脏颜色变化，若变成暗紫色提示结扎成功，依据实验分组??于大鼠梗死区（注射３个点
缝合气管切口及皮肤，消毒。尾静脉注射重组慢病毒（５００ｕｌ／周）。??１．２．５细胞实验干预??筛选有效敲除Ｃ３Ｇ的重组慢病毒（图３）。将相同数量的Ｈ９Ｃ２细胞接种于将相??同数量的Ｈ９Ｃ２细胞接种于孔板（２份）中，分别感染ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９和Ｃ３Ｇ??ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９慢病毒，培养４５ｈ。从上述２份孔板中随机取出一份将培养基换成ＰＢＳ??后，置于３７°Ｃ、１％０２、９４％Ｎ２、５％Ｃ０２的低氧孵箱中培养１８ｈ，另一份继续培??养?１８ｈ，此时细胞分为?ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃ３Ｇ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＮＴ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?低??氧和?Ｃ３ＧＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?低氧组。收集细胞，ＲＴ－ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ、ＣＣＫ－８?及流式??细胞术检测。??＾?＾?＾?＾?＾??＾?＾?＾?＾?＾??Ｚ?Ｚ?Ｚ?Ｚ?Ｚ?Ｚ??ｋＤａ?４?Ｃ？＆?＃?Ｃ？。夕?Ｃ？＞＆??３７一?？一鱗？？?ＧＡＰＤＨ??１２１—??图３?Ｃ３Ｇ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９重组慢病毒筛选??Ｆｉｇ．３?Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ?ｏｆ?Ｃ３Ｇ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ??１．２．６超声心动图检测??于心梗后１Ｗ及１２Ｗ，将大鼠腹腔麻醉并备皮，彩色多普勒超声检测心脏射血??分数（ＥＦ％），左室舒张末直径（ＬＶＤｄ）及舒张期左室后壁厚度（ＬＶＰＷｄ）。??１．２．７标本采集和心室质量测定??心梗后１２Ｗ
【参考文献】：
期刊论文
[1]C3G基因对H9C2心肌细胞凋亡和增殖的影响[J]. 杨东艳,李刚,张蕾,张志升,扶艳波,胡苏蕾. 解放军医学杂志. 2015(08)
[2]鸟苷酸交换因子C3G对心肌细胞生存力的影响及其可能机制[J]. 张旭,李刚. 第二军医大学学报. 2012(11)
本文编号：3470282
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