Holt-Oram综合征家系致病基因TBX5的新突变鉴定及功能研究
发布时间：2021-12-15 19:23
背景Holt-Oram综合征,又称心手综合征,患者有先天性心脏病伴上肢畸形的临床表现。该疾病属于常染色体显性遗传病,具有完全外显性,临床表现包括先天性房间隔和室间隔缺失、心脏传导功能障碍、上肢骨骼异常、拇指畸形。患者的子代中有50%的可能性发生新生儿出生缺陷,严重者会导致胎儿死亡或夭折,给患者家庭造成极大负担。研究发现,TBX5基因突变是Holt-Oram综合征的主要遗传学因素,约70%的患者存在该基因异常。该基因位于12号染色体,转录后形成的TBX5蛋白是胚胎发育过程中调控心脏和上肢发育的重要转录因子。目前在TBX5基因编码区、剪接区和调控区均发现了导致Holt-Oram综合征的基因突变。另外,约30%该疾病患者病因尚不明确,可能存在其他影响心脏和上肢胚胎发育的调控元件。TBX5基因突变的异质性和其与Holt-Oram综合征的相关性提示,该基因在胚胎发育中具有重要调控作用和研究价值。目的鉴定Holt-Oram综合征家系的致病基因和遗传方式,为患者提供遗传咨询;鉴定TBX5基因新突变,丰富Holt-Oram综合征基因突变异质性研究,拓宽基因突变谱;针对TBX5基因新突变的功能研究,揭示...
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２．１?Ｔ５Ｘ５?ｃＤＮＡ原质粒图谱及ＰＣＲ引物结合区域??（Ａ：?：Ｔ５Ｚ５ｃＤＮＡ原质粒图谱；Ｂ和Ｃ：质粒Ｎ端和Ｃ端ＰＣＲ引物结合区域）??
?材料与方法???蓝指示位置超过凝胶１／２时可结束电泳。??显影：使用ＣｈｅｍｉＤｏｃ?ＭＰ成像仪显影，选择Ｉｍａｇｅ?Ｌａｂ程序并预热，将加??样孔朝上置于成像板内并驱除接触面的气泡。显影后根据Ｍａｒｋｅｒ指示确定目标??条带位置（约１．６?ｋｂ）并保存图片，条带位置见图２．２。??Ｍａｒｋｅｒ?ｗｔ?ｆｌａｇ－ＴＢＸ５??图２．２?７５Ｘ５基因扩增后的琼脂糖凝胶电泳图??ｅ）胶回收得到纯化的目的基因片段：??佩戴紫外线防护眼镜，使用Ｅ－Ｇｅｌ?Ｓａｆｅ?Ｉｍａｇｅｒ透射仪直视下切割目的片段，??尽量靠近目的区域以减小切割体积，将切下的凝胶块装入１．５?ｍｌ离心管内并称??重。胶回收的纯化过程均在室温下进行，离心转速＞１２０００?ｇ。??按照１：１的比例向凝胶内加入Ｂｉｎｄｉｎｇ?Ｂｕｆｆｅｒ，置于５５°Ｃ金属浴中孵育１０??ｍｉｎ使凝胶完全溶解；将溶解后的凝胶转移至ＧｅｎｅＪＥＴ纯化柱内，离心１?ｍｉｎ，??倒掉收集管内的液体；向纯化柱内加入７００ｕｌＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ?（已加入需要量的无水??乙醇），离心ｌｍｉｎ，倒掉收集管内的液体，再离心１ｍｍ以去除残留的乙醇成分；??将纯化柱转移至干净的１．５ｍｌ离心管内，向纯化柱膜中央滴加２０ｕｌ洗脱液，离??心ｌｍｍ，离心管内即得到纯化的目的片段。测量浓度，并记录。??③酶切目的基因和质粒载体并纯化回收：??连有Ｈａｇ标签的目的基因ＴＡＹ５两侧有限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｐｍｅｌ??序列，质粒载体ｐＣＭＶ６的开放阅读框两侧也含有ＢａｍＨＩ和Ｐｍｅｌ序列，双酶切??可获得ＢａｍＨＩ酶切后的黏末端和Ｐｍｅｌ酶切后的平末端。通过琼脂糖凝胶电泳，??根据片段长度对
?材料与方法???ａ）目的基因和质粒载体的酶切???试剂名称????ＢａｍＨＩ?酶?１?ｕｌ??Ｐｍｅｌ?酶?１?ｕｌ??ｌＯｘＮＥＢｕｆｆｅｒ?５?ｕｌ??目的基因／质粒载体ＤＮＡ?１?ｕｇ??去离子水?Ｓ?５０?ｕｌ???按照上表配制５０ｕｌ的酶切体系，注意酶最后加入并吹打混匀。置于３７°Ｃ孵??育１?ｈ，使酶充分发挥作用。??ｂ）纯化回收目的片段??将酶切后的反应体系进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图２．３：连有Ｆｌａｇ标签的??目的基因片段大小约１．６?ｋｂ，质粒载体酶切后获得约４．８?ｋｂ大小的ｐＣＭＶ６??骨架和约１．６?ｋｂ大小的开放阅读框区域。切胶回收目的基因的１．６?ｋｂ区域和质??粒载体的４．８?ｋｂ区域。具体步骤同２．２．４－（１）－②－ｃ）．ｄ）．ｅ）所述。??圓??图２．３目的基因和质粒载体ｐＣＭＶ６酶切后的琼脂糖凝胶电泳图??④连接目的基因和质粒载体：??使用Ｔ４?ＤＮＡ连接酶使质粒载体和目的基因上经过ＢａｍＨＩ酶切形成的黏末??端互补配对结合并连接，同时Ｐｍｅｌ酶切形成的平末端相连，形成闭合完整的环??状质粒结构。???试剂名称????Ｔ４?ＤＮＡ?Ｌｉｇａｓｅ?１?ｕｌ??ｌ〇ｘＴ４?ＤＮＡ?Ｌｉｇａｓｅ?Ｂｕｆｆｅｒ?２?ｕｌ??质粒载体?ＤＮＡ（４．８?ｋｂ）?６０?ｎｇ?（０．０３２?ｐｍｏｌ）??目的基因?ＤＮＡ（１．６?ｋｂ）?６０?ｎｇ?（０．０９６?ｐｍｏｌ）??去离子水?至２０ｕｌ???１５??
【参考文献】：
期刊论文
[1]遗传变异分类标准与指南[J]. 王秋菊,沈亦平,邬玲仟,陈少科,陈子江,方向东,傅松滨,龚瑶琴,黄国英,黄国宁,黄荷凤,黄山,郝晓柯,冀小平,李红,梁波,廖灿,乔杰,苏海翔,魏军,王磊,王树玉,王晓红,邢清和,徐湘民,袁慧军,杨正林,周从容,周文浩,曾勇,张学军,黄涛生,郑茜,秦胜营,于世辉,关静,王洪阳,王大勇,赵立东,王慧君,孔令印,宣黎明,冒燕,祝轶君,徐君玲,王剑青,王莉,赵婷,秦一丁,夏滢颖,樊丽霞,赵丁丁,邱浩,贺林. 中国科学:生命科学. 2017(06)
本文编号：3537006
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２．１?Ｔ５Ｘ５?ｃＤＮＡ原质粒图谱及ＰＣＲ引物结合区域??（Ａ：?：Ｔ５Ｚ５ｃＤＮＡ原质粒图谱；Ｂ和Ｃ：质粒Ｎ端和Ｃ端ＰＣＲ引物结合区域）??
?材料与方法???蓝指示位置超过凝胶１／２时可结束电泳。??显影：使用ＣｈｅｍｉＤｏｃ?ＭＰ成像仪显影，选择Ｉｍａｇｅ?Ｌａｂ程序并预热，将加??样孔朝上置于成像板内并驱除接触面的气泡。显影后根据Ｍａｒｋｅｒ指示确定目标??条带位置（约１．６?ｋｂ）并保存图片，条带位置见图２．２。??Ｍａｒｋｅｒ?ｗｔ?ｆｌａｇ－ＴＢＸ５??图２．２?７５Ｘ５基因扩增后的琼脂糖凝胶电泳图??ｅ）胶回收得到纯化的目的基因片段：??佩戴紫外线防护眼镜，使用Ｅ－Ｇｅｌ?Ｓａｆｅ?Ｉｍａｇｅｒ透射仪直视下切割目的片段，??尽量靠近目的区域以减小切割体积，将切下的凝胶块装入１．５?ｍｌ离心管内并称??重。胶回收的纯化过程均在室温下进行，离心转速＞１２０００?ｇ。??按照１：１的比例向凝胶内加入Ｂｉｎｄｉｎｇ?Ｂｕｆｆｅｒ，置于５５°Ｃ金属浴中孵育１０??ｍｉｎ使凝胶完全溶解；将溶解后的凝胶转移至ＧｅｎｅＪＥＴ纯化柱内，离心１?ｍｉｎ，??倒掉收集管内的液体；向纯化柱内加入７００ｕｌＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ?（已加入需要量的无水??乙醇），离心ｌｍｉｎ，倒掉收集管内的液体，再离心１ｍｍ以去除残留的乙醇成分；??将纯化柱转移至干净的１．５ｍｌ离心管内，向纯化柱膜中央滴加２０ｕｌ洗脱液，离??心ｌｍｍ，离心管内即得到纯化的目的片段。测量浓度，并记录。??③酶切目的基因和质粒载体并纯化回收：??连有Ｈａｇ标签的目的基因ＴＡＹ５两侧有限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｐｍｅｌ??序列，质粒载体ｐＣＭＶ６的开放阅读框两侧也含有ＢａｍＨＩ和Ｐｍｅｌ序列，双酶切??可获得ＢａｍＨＩ酶切后的黏末端和Ｐｍｅｌ酶切后的平末端。通过琼脂糖凝胶电泳，??根据片段长度对
?材料与方法???ａ）目的基因和质粒载体的酶切???试剂名称????ＢａｍＨＩ?酶?１?ｕｌ??Ｐｍｅｌ?酶?１?ｕｌ??ｌＯｘＮＥＢｕｆｆｅｒ?５?ｕｌ??目的基因／质粒载体ＤＮＡ?１?ｕｇ??去离子水?Ｓ?５０?ｕｌ???按照上表配制５０ｕｌ的酶切体系，注意酶最后加入并吹打混匀。置于３７°Ｃ孵??育１?ｈ，使酶充分发挥作用。??ｂ）纯化回收目的片段??将酶切后的反应体系进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图２．３：连有Ｆｌａｇ标签的??目的基因片段大小约１．６?ｋｂ，质粒载体酶切后获得约４．８?ｋｂ大小的ｐＣＭＶ６??骨架和约１．６?ｋｂ大小的开放阅读框区域。切胶回收目的基因的１．６?ｋｂ区域和质??粒载体的４．８?ｋｂ区域。具体步骤同２．２．４－（１）－②－ｃ）．ｄ）．ｅ）所述。??圓??图２．３目的基因和质粒载体ｐＣＭＶ６酶切后的琼脂糖凝胶电泳图??④连接目的基因和质粒载体：??使用Ｔ４?ＤＮＡ连接酶使质粒载体和目的基因上经过ＢａｍＨＩ酶切形成的黏末??端互补配对结合并连接，同时Ｐｍｅｌ酶切形成的平末端相连，形成闭合完整的环??状质粒结构。???试剂名称????Ｔ４?ＤＮＡ?Ｌｉｇａｓｅ?１?ｕｌ??ｌ〇ｘＴ４?ＤＮＡ?Ｌｉｇａｓｅ?Ｂｕｆｆｅｒ?２?ｕｌ??质粒载体?ＤＮＡ（４．８?ｋｂ）?６０?ｎｇ?（０．０３２?ｐｍｏｌ）??目的基因?ＤＮＡ（１．６?ｋｂ）?６０?ｎｇ?（０．０９６?ｐｍｏｌ）??去离子水?至２０ｕｌ???１５??
【参考文献】：
期刊论文
[1]遗传变异分类标准与指南[J]. 王秋菊,沈亦平,邬玲仟,陈少科,陈子江,方向东,傅松滨,龚瑶琴,黄国英,黄国宁,黄荷凤,黄山,郝晓柯,冀小平,李红,梁波,廖灿,乔杰,苏海翔,魏军,王磊,王树玉,王晓红,邢清和,徐湘民,袁慧军,杨正林,周从容,周文浩,曾勇,张学军,黄涛生,郑茜,秦胜营,于世辉,关静,王洪阳,王大勇,赵立东,王慧君,孔令印,宣黎明,冒燕,祝轶君,徐君玲,王剑青,王莉,赵婷,秦一丁,夏滢颖,樊丽霞,赵丁丁,邱浩,贺林. 中国科学:生命科学. 2017(06)
本文编号：3537006
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