基于诱导多能干细胞模型研究法洛四联症的转录调控机制
发布时间：2022-01-12 02:59
[研究背景和目的]先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）是人类最常见的出生缺陷疾病,是导致婴幼儿非感染性疾病中最主要的死亡原因。法洛四联症（Tetralogy of Fallot,TOF）是最常见的复杂性、紫绀性CHD,其死亡率较高,在10岁内,未经治疗的患者死亡率高达70-75%,但是由于目前缺乏相应的疾病模型,TOF的基因学、细胞学及分子学病因仍未明确。因此,我们需要一种新的工具或疾病模型系统来对TOF进行研究,使我们更好的探索其发生及发展过程中的病理生理学机制。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）是利用重编程技术向体细胞内导入重编程因子得到的一种具有与胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ESCs）相似的全能性的细胞,基于其明确的基因背景等特点,iPSCs为发育生物学及遗传疾病的病因生物学的研究提供了一种全新的思路。在心血管疾病的研究中,由于其能较好的保留样本的遗传背景,同时能很好的模拟心脏的发育过程,iPSCs为探索遗传变异导致的心脏发育异常提供了一个独特的细胞平台。基于以上理...
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：163 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２皮肤成纤维细胞的组织块贴壁培养（Ａ）组织块贴壁培养约７天后可见梭型细胞从组织??块边缘逐渐爬出；（Ｂ）培养约两周后组织块周围贴壁的梭型细胞明显增多；（Ｃ）细胞第一??次传代培养后细胞融合度达到５０－６０％；?（Ｄ）细胞生长融合度到达８０－９０％
维细胞传代接种第１？２天细胞处于潜伏期，增殖相对不明显，第３？５天进入对数??增殖期，细胞增殖加速；第５－７天进入平台期，三株细胞增殖能力基本相似，生??长曲线相似，均呈现为“Ｓ”型，证实５株细胞均具有较好的增殖能力（如图４）。??－ｍ－?ＨＦＦ－１??２〇?＋?ＨＦＦ－２??ＴＯＦ－１??１．５－?＋?ＴＯＦ－２??〇?＋?ＴＯＦ－３??Ｉ－?ｙ??。５??０．０－１?１?１?ｉ?１??０?２?４?６?８??Ｄａｙ??图４人皮肤成纤维细胞的增殖曲线使用ＣＣＫ８法对５株原代培养的成纤维细胞生长曲线进??行检测，５株细胞均具有较好的增殖能力。??Ｆｉｇｕｒｅ．４?Ｔｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅｓ?ｏｆ?ｈｕｍａｎ?ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ．?Ｔｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅｓ?ｏｆ?ｆｉｖｅ?ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ?ｗｅｒｅ??ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ＣＣＫ８?ｍｅｔｈｏｄ，?ａｌｌ?ｔｈｅ?ｆｉｖｅ?ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅｓ?ｈａｄ?ｇｏｏｄ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ａｂｉｌｉｔｙ．??３．诱导多能干细胞的建立及鉴定??３．１皮肤成纤维细胞的重编程??在成纤维细胞融合度到达约８０％后，进行成纤维细胞的重编程。在病毒感染??后第５天，显微镜下观察皮肤成纤维细胞可见细胞形态总体仍然呈现为梭形或不??规则的三角形，有部分细胞逐渐变圆，部分细胞发生聚集现象（图５Ａ）；继续进??行换液培养，在病毒转染后约第１０天，显微镜下可见重编程的细胞己经明显聚??集成小克隆状的卵圆形（图５Ｂ）；在细胞转染后约３０天，可在显微镜下观察到??细胞克隆逐渐出现，克隆呈现为不规则圆形的突起，中心部位细胞聚集较密集，??而边
ａ?ｆｌＨＨＨＩｌＨ?Ｂ?ｆｌＨＨＨＨＩ??２５０｜＾ｒｉ?２５０＾ｍ??Ｄａｙ?５?（?４０Ｘ?）?Ｄａｙ?１０?（?４０Ｘ?）??Ｃ?Ｄ??ＷＭ－＇－ｃ－：?－?■?ｒ＇－＇－＇??士．?．．??Ｄａｙ?３０?（?４０Ｘ?）?Ｄａｙ?６０?（?４０Ｘ?）??图５人皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的过程（Ａ）成纤维细胞转染后第５天，??可见少量细胞开始聚集；（Ｂ）成纤维细胞转染后第１０天，可见细胞聚集为卵圆形；（Ｃ）成??纤维细胞转染后第３０天，可见细胞克隆形成；（Ｄ）成纤维细胞转染后第６０天，类ＥＳＣｓ??样细胞挑选并传代培养后，呈现为克隆样生长。??Ｆｉｇｕｒｅ．５?Ｈｕｍａｎ?ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ?ｗｅｒｅ?ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ?ｉｎｔｏ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ?ｓｔｅｍ?ｃｅｌｌｓ．?（Ａ）?Ｏｎ??ｄａｙ?５?ａｆｔｅｒ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，?ａ?ｓｍａｌｌ?ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｃｅｌｌｓ?ｂｅｇａｎ?ｔｏ?ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ．?（Ｂ）?Ｏｎ?ｄａｙ?１０?ａｆｔｅｒ??ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，?ｔｈｅ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｂｅｇａｎ?ｔｏ?ｆｏｒｍ?ｂｌｏｃｋ?ｍａｓｓ．?（Ｃ）?３０?ｄａｙｓ?ａｆｔｅｒ?ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，??Ｃｅｌｌｓ?ｃｌｏｎｅｓ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ．?（Ｄ）?Ｏｎ?ｄａｙ?６０?ｄａｙ?ａｆｔｅｒ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，?ｔｈｅ?ＥＳＣ－ｌｉｋｅ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｓｅｌｅｃｔｅｄ??ａｎｄ?ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ?ａｎｄ?ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ａｓ?ｃｌｏｎｅ?ｇｒｏｗｔｈ．?
本文编号：3583970
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：163 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２皮肤成纤维细胞的组织块贴壁培养（Ａ）组织块贴壁培养约７天后可见梭型细胞从组织??块边缘逐渐爬出；（Ｂ）培养约两周后组织块周围贴壁的梭型细胞明显增多；（Ｃ）细胞第一??次传代培养后细胞融合度达到５０－６０％；?（Ｄ）细胞生长融合度到达８０－９０％
维细胞传代接种第１？２天细胞处于潜伏期，增殖相对不明显，第３？５天进入对数??增殖期，细胞增殖加速；第５－７天进入平台期，三株细胞增殖能力基本相似，生??长曲线相似，均呈现为“Ｓ”型，证实５株细胞均具有较好的增殖能力（如图４）。??－ｍ－?ＨＦＦ－１??２〇?＋?ＨＦＦ－２??ＴＯＦ－１??１．５－?＋?ＴＯＦ－２??〇?＋?ＴＯＦ－３??Ｉ－?ｙ??。５??０．０－１?１?１?ｉ?１??０?２?４?６?８??Ｄａｙ??图４人皮肤成纤维细胞的增殖曲线使用ＣＣＫ８法对５株原代培养的成纤维细胞生长曲线进??行检测，５株细胞均具有较好的增殖能力。??Ｆｉｇｕｒｅ．４?Ｔｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅｓ?ｏｆ?ｈｕｍａｎ?ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ．?Ｔｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅｓ?ｏｆ?ｆｉｖｅ?ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ?ｗｅｒｅ??ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ＣＣＫ８?ｍｅｔｈｏｄ，?ａｌｌ?ｔｈｅ?ｆｉｖｅ?ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅｓ?ｈａｄ?ｇｏｏｄ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ａｂｉｌｉｔｙ．??３．诱导多能干细胞的建立及鉴定??３．１皮肤成纤维细胞的重编程??在成纤维细胞融合度到达约８０％后，进行成纤维细胞的重编程。在病毒感染??后第５天，显微镜下观察皮肤成纤维细胞可见细胞形态总体仍然呈现为梭形或不??规则的三角形，有部分细胞逐渐变圆，部分细胞发生聚集现象（图５Ａ）；继续进??行换液培养，在病毒转染后约第１０天，显微镜下可见重编程的细胞己经明显聚??集成小克隆状的卵圆形（图５Ｂ）；在细胞转染后约３０天，可在显微镜下观察到??细胞克隆逐渐出现，克隆呈现为不规则圆形的突起，中心部位细胞聚集较密集，??而边
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本文编号：3583970
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