基于适体技术体外检测血管内皮生长因子165

发布时间：2023-02-06 11:18

　　血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是体内重要的血管生长因子，促进内皮细胞分裂增殖和新血管的生成。VEGF165是VEGF家族中活性最强的因子，在内皮细胞相关的基础研究、信号途径、临床诊断等方面具有重要作用，因此如何对其进行准确快速的检测已经成为研究的重点。常用检测蛋白方法是以抗体为工具，因其本身的缺陷，限制了其应用。核酸适体为一段寡聚单链DNA或RNA分子，与抗体相比具有较高的特异性和亲和性，同时具有稳定性好、制备周期短、免疫原性小、靶分子范围广等优点，作为可替代抗体的适体，在科学研究、临床诊断和治疗中具有很好的前景。 本文首先探讨了以适体替代抗体通过点杂交和Eastern blotting方法体外检测非还原状态和还原状态的VEGF165。并和以抗体做的结果进行比较。另外，本文还利用基于适体的局部保护原理（Aptamer-Based Regionally Protected PCR,ARP-PCR），对VEGF165蛋白进行检测。适体与蛋白孵育结合后，加入DNase I将未与蛋白结合的适体酶切掉，由于蛋白的保护作用... 

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 VEGF_(165)的研究进展
        1.1.1 VEGF_(165)的结构及特性
        1.1.2 VEGF_(165)的信号通路
        1.1.3 VEGF_(165)的生物学功能
        1.1.4 VEGF_(165)的促血管生成机制
        1.1.5 VEGF_(165)与肿瘤的关系
        1.1.6 以 VEGF 和 VEGFR 为靶点抗肿瘤血管治疗
    1.2 适体的研究进展
        1.2.1 核酸适体的优势
        1.2.2 SELEX 技术基本流程与分类
        1.2.3 适体检测方面的应用
    1.3 课题选题依据
第2章 点杂交和 Eastern blotting 法检测蛋白
    2.1 实验材料、试剂及仪器
        2.1.1 主要实验试剂
        2.1.2 主要实验仪器
        2.1.3 主要试剂的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 点杂交验证生物素和链霉亲和素的结合
        2.2.2 点杂交以抗体检测非还原 VEGF_(165)蛋白
        2.2.3 点杂交以适体检测非还原 VEGF_(165)蛋白
        2.2.4 Western blotting 以抗体检测还原 VEGF_(165)蛋白
        2.2.5 Eastern blotting 以适体检测还原 VEGF_(165)蛋白
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 点杂交验证生物素和链霉亲和素的结合
        2.3.2 点杂交以抗体检测非还原 VEGF_(165)蛋白
        2.3.3 点杂交以适体检测非还原 VEGF_(165)蛋白
        2.3.4 Western blotting 以抗体检测还原 VEGF_(165)蛋白
        2.3.5 Eastern blotting 以适体检测还原 VEGF_(165)蛋白
    2.4 小结
第3章 优化酶切保护检测蛋白的方法
    3.1 实验材料、试剂及仪器
        3.1.1 主要实验试剂
        3.1.2 主要实验仪器
        3.1.3 主要试剂的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 优化 50bp marker 的电泳条件
        3.2.2 Real-time PCR 优化适体扩增循环次数
        3.2.3 优化酶切产物扩增的 PCR 体系
        3.2.4 优化酶切过程中 DNase I 的用量
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 优化 50bp marker 的电泳条件
        3.3.2 Real-time PCR 检测适体扩增过程
        3.3.3 优化酶切产物扩增的 PCR 体系
        3.3.4 优化酶切过程中 DNase I 的用量
    3.4 小结
第4章 ARP-PCR 法的可行性验证
    4.1 实验材料、试剂及仪器
        4.1.1 主要实验试剂
        4.1.2 主要实验仪器
        4.1.3 主要试剂的配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 普通 PCR 验证引物可行性
        4.2.2 未加蛋白下 DNase I 的酶切情况
        4.2.3 加蛋白下 DNase I 的酶切情况
        4.2.4 ARP-PCR 法特异性检测
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 普通 PCR 验证引物可行性
        4.3.2 未加蛋白下 DNase I 的酶切情况
        4.3.3 加蛋白下 DNase I 的酶切情况
        4.3.4 ARP-PCR 法特异性检测
    4.4 小结
第5章 利用 Exo I 的酶切检测
    5.1 实验材料、试剂及仪器
        5.1.1 主要实验试剂
        5.1.2 主要实验仪器
        5.1.3 主要试剂的配制
    5.2 实验方法
        5.2.1 未加蛋白下 Exo I 的酶切情况
        5.2.2 变构作用和缓冲液对酶切的影响
        5.2.3 Exo I 的用量对酶切的影响
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 未加蛋白下 Exo I 的酶切情况
        5.3.2 变构作用和缓冲液对酶切的影响
        5.3.3 Exo I 的用量对酶切的影响
    5.4 小结
第6章 总结
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3735901