PDGFBB通过下调miR-1281/EP300促进肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的分子机制研究

发布时间：2023-03-23 23:47

　　引言:肺动脉高压(PAH)是一种致命性心血管疾病,发病率和死亡率都很高,仅次于高血压和冠脉综合征,素有“心血管系统的恶性肿瘤”之称。血小板衍生生长因子BB(PDGFBB)是血管平滑肌细胞最强的致有丝分裂原和趋化因子。microRNA(miRNA)是一类小分子非编码RNA。在哺乳类动物细胞,miRNA主要是通过与靶基因mRNA 3’端非翻译区(3’-UTR)特异结合,使靶基因mRNA降解或翻译受阻,从而在转录后水平调控靶基因的表达。体内miRNA的异常表达与多种疾病的发生发展密切相关。为了探讨与PAH相关的miRNA,本课题组在肺动脉平滑肌细胞(PASMC)鉴定了受PDGFBB调控的miRNA,其中包括下调最明显的mi R-1281。基因组结构分析发现,pre-miR-1281与其下游基因E1A结合蛋白p300(EP300)可能来自于同一个转录本。PDGFBB也能显著下调EP300的表达。EP300是具有抑癌作用的组蛋白乙酰基转移酶,目前在肿瘤方面的研究报道较多,但在肺高压方面尚未见任何报道。目的:研究PDGFBB下调miR-1281/EP300表达在PASMC异常增殖和迁移过程中的功能...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 肺动脉高压概述
    1.2 PDGF在肺动脉高压中的概述
    1.3 miRNA的研究概述
    1.4 miRNA在肺动脉高压中的调控作用
    1.5 组蛋白乙酰化在肺动脉高压中的研究进展
    1.6 EP300在细胞中的研究进展
    1.7 本课题研究目的、内容与意义
第2章 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 分子克隆相关试剂
        2.1.2 细胞培养相关试剂
        2.1.3 药物和转染试剂
        2.1.4 荧光定量PCR相关试剂
        2.1.5 westernblots相关试剂
        2.1.6 动物实验相关试剂
        2.1.7 其他试剂
        2.1.8 分子生物学相关软件
    2.2 仪器与耗材
        2.2.1 细胞系
        2.2.2 动物
        2.2.3 细胞培养相关仪器
        2.2.4 细菌实验相关仪器
        2.2.5 离心机
        2.2.6 PCR相关仪器
        2.2.7 DNA/RNA浓度测量仪器
        2.2.8 核酸电泳相关仪器
        2.2.9 蛋白质检测相关仪器
        2.2.10 显微镜
        2.2.11 荧光素酶活性检测仪器
        2.2.12 其他仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 RPASMC原代细胞分离
            2.3.1.1 大鼠心脏和肺动脉组织获取
            2.3.1.2 细胞分离
        2.3.2 瞬时转染
            2.3.2.1 质粒PEI转染
            2.3.2.2 miRNAmimic和siRNA的SI转染
        2.3.3 细胞培养
            2.3.3.1 常氧下细胞培养
            2.3.3.2 缺氧下细胞培养
        2.3.4 荧光定量PCR
            2.3.4.1 总RNA的提取
            2.3.4.2 miRNA的检测
            2.3.4.3 mRNA的检测
        2.3.5 Westernblot检测蛋白质的表达水平
        2.3.6 细胞功能实验
            2.3.6.1 细胞增殖实验
            2.3.6.2 细胞迁移实验
        2.3.7 miRNA靶基因的生物学预测
        2.3.8 3′-UTR荧光素酶报告基因测定
        2.3.9 数据处理
第3章 结果与分析
    3.1 miR-1281通过靶向HDAC4调控RPASMC的增殖和迁移
        3.1.1 在PASMCs中PDGFBB诱导miR-1281显著下调
        3.1.2 miR-1281抑制PASMCs的增殖和迁移
        3.1.3 在RPASMC细胞中HDAC4是miR-1281的靶基因
        3.1.4 HDAC4促进PASMCs的增殖和迁移
        3.1.5 PDGFBB诱导DNMT1上调进而抑制miR-1281的表达
        3.1.6 在低氧刺激的PASMCs、MCT诱导PAH大鼠的肺动脉和CHD-PAH患者的血清中miR-1281表达水平下调
        3.1.7 miR-1281调节肺动脉平滑肌细胞的分子机制模型
    3.2 PDGFBB通过上调DNMT1抑制EP300进而调控RPASMC的增殖和迁移
        3.2.1 在PASMCs中PDGFBB诱导EP300显著下调
        3.2.2 不同细胞中,PDGFBB刺激下EP300的表达情况
        3.2.3 EP300抑制PASMCs的增殖和迁移
        3.2.4 在PDGF通路中调控EP300的EGR1不是关键机制
        3.2.5 过表达miR-1281并不能调控EP300的表达
        3.2.6 敲除CpG岛能上调EP300的表达
        3.2.7 在PDGFBB刺激下,5-aza-dc能回复EP300的表达
        3.2.8 PDGFBB刺激下PASMC中DNMT家族的表达情况
        3.2.9 EP300调节肺动脉平滑肌细胞的分子机制模型
第4章 讨论
    4.1 在肺动脉平滑肌细胞的异常增殖中,miR-1281参与调控的信号通路及靶基因
    4.2 在PDGF信号通路中,DNMT1在肺动脉高压中的调控机制
    4.3 在PDGF信号通路中,参与调控组蛋白乙酰化转移酶EP300的分子机制
第5章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间的研究成果



本文编号：3768999