移植人胚胎干细胞来源心血管前体细胞改善非人灵长类心肌梗死后心功能

发布时间：2023-04-21 22:50

　　研究背景及目的:我国心血管疾病高居致死病因首位,且持续上升。心肌梗死可以造成心肌细胞不可逆的损伤和丢失,且现有的手段难以逆转心梗后心肌衰竭的进程。如何减少心梗后心肌细胞丢失、促进功能重建是心血管研究领域的重大问题。由于人多能干细胞可在体外无限增殖,并可分化为各种心血管细胞,移植干细胞及衍生细胞为心梗后心肌修复带来希望。人胚胎干细胞衍生心血管前体细胞具有显著的治疗心肌梗死的疗效。本研究的目的是验证胚胎干细胞衍生心血管前体细胞的治疗有效性和安全性,同时探索不同免疫抑制剂方案对人多能干细胞大动物研究的效果。我们在使用了不同免疫抑制剂的非人灵长类动物中建立心梗模型,并在心梗后将人胚胎干细胞来源心血管前体细胞移植进入动物心脏中,通过多种评价方法,对其治疗作用与潜在机制做进一步研究。方法和结果:我们利用之前建立的方法,运用单层分化方法,成功将人胚胎干细胞高效地诱导为心血管前体细胞。在使用了环孢霉素(cyclosporine)和联合使用环孢霉素,甲强龙和舒莱(MDR)的食蟹猴中构建了心梗模型,在心梗后30min后,将107人胚胎干细胞衍生心血管前体细胞心肌内注射进入不同食蟹猴梗死周边区。同时,本研究...

【文章页数】：107 页

【学位级别】：博士

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致谢
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缩略词表
1 引言
2 实验材料
    2.1 实验动物
    2.2 实验仪器
    2.3 实验试剂
    2.4 细胞培养试剂
3 实验方法
    3.1 细胞培养
        3.1.1 人胚胎干细胞hESC的复苏
        3.1.2 人胚胎干细胞hESC的培养
        3.1.3 人胚胎干细胞hESC的传代
        3.1.4 人胚胎干细胞hESC的冻存
        3.1.5 人胚胎干细胞碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性的鉴定
        3.1.6 表达EGFP的人胚胎干细胞hESC建立
    3.2 人胚胎干细胞向心血管前体细胞(cardiovascular progenitor cells,CVPCs)分化
    3.3 流式细胞术鉴定细胞
    3.4 人胚胎干细胞hESC和心血管前体细胞(CVPC)的免疫荧光染色
    3.5 动物实验
        3.5.1 食蟹猴的免疫抑制剂方案
        3.5.2 食蟹猴心梗手术与细胞移植
        3.5.3 食蟹猴心脏超声检测
        3.5.4 食蟹猴的血常规和肝肾功能检测
        3.5.5 食蟹猴的处死与组织留存
    3.6 聚合酶链式反应
        3.6.1 基因组DNA的提取
        3.6.2 荧光定量PCR
    3.7 Western Blot
        3.7.1 总蛋白提取
        3.7.2 总蛋白定量
        3.7.3 SDS-PAGE凝胶电泳
        3.7.4 转膜(湿法)
        3.7.5 封闭,抗体结合和显影
    3.8 组织学检测
        3.8.1 组织样品冰冻切片
        3.8.2 免疫组化染色
    3.9 统计学方法
4 结果
    4.1 hESCs的多能性鉴定
    4.2 hESCs定向分化为心血管前体细胞(CVPCs)
    4.3 hESC-CVPCs的免疫源性检测
    4.4 多种免疫抑制剂组合MDR能提高移植的hESC-CVPCs细胞驻留
    4.5 联合免疫抑制剂MDR能减少食蟹猴对hESC-CVPCs免疫排斥
    4.6 多种免疫抑制剂组合MDR能够显著增强hESC-CVPCs的抗凋亡作用
    4.7 移植人胚胎干细胞衍生心血管前体细胞(hESC-CVPCs)可以显著改善心梗后非人灵长类动物心功能
    4.8 免疫抑制剂的肝毒性
5 讨论
参考文献
综述
    参考文献
作者简介



本文编号：3796401