胸腺素β4真核表达载体及α肌球蛋白重链启动子驱动报告载体的构建及其应用

发布时间：2023-12-13 17:55

　　目的：本文主要有三个目的：1）构建胸腺素β4真核表达载体以用于基因靶向治疗；2）构建α肌球蛋白重链启动子驱动报告载体以用于示踪成体干细胞向心肌分化；3）探索能靶向缺血心肌血管的靶向子MI1对骨髓间充质干细胞进行表面修饰的最适浓度。 方法：1）利用pBlast49、pcDNA3.0-Flag、pIRES2-eGFP三种载体构建能在真核细胞表达胸腺素β4的表达载体，并将这三种重组子转染到293T、293F、HUVEC三种细胞中，并通过Real-time PCR、Western Blot及Elisa三种方法检测胸腺素β4的表达情况；2）利用α肌球蛋白重链的启动子特异性驱动增强型绿色荧光蛋白以构建心肌特异性报告载体。在新生鼠心肌细胞内确定该报告载体的心肌组织特异性。将该报告载体经电转转染入大鼠骨髓间充质干细胞内，经诱导向心肌分化，然后通过是否表达绿色荧光蛋白，及使用三型心肌肌钙蛋白I的免疫荧光确认向心肌分化，以确定经构建载体可用性；3）使用50、250、500、1000、1500μg/mL的能靶向缺血心肌血管的靶向子MI1对骨髓间充质干细胞进行表面修饰，并对MI1表面修饰的骨髓间充质干细胞的贴...

【文章页数】：123 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 心肌梗死
    1.2 胸腺素β4
    1.3 α肌球蛋白重链启动子
    1.4 干细胞治疗心肌梗死
    1.5 本文研究目的
第二章 胸腺素β4 真核表达载体的构建及其体外活性鉴定
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 基因载体及细胞
        2.2.2 主要试剂
        2.2.3 主要仪器设备
    2.3 方法
        2.3.1 目的基因的扩增
        2.3.2 琼脂糖核酸电泳及 DNA 凝胶回收
        2.3.3 酶切及酶连
        2.3.4 热敏感受态细胞的制备
        2.3.5 热敏转化及阳性克隆筛选
        2.3.6 质粒抽提及序列测定
        2.3.7 细胞培养及脂质体转染
        2.3.8 细胞免疫荧光
        2.3.9 细胞总蛋白及总 RNA 抽提
        2.3.10 Realtime PCR 检测 Tβ4 mRNA 表达水平
        2.3.11 Elisa 测定 Tβ4 蛋白含量
        2.3.12 Western Blot 检测 Tβ4 蛋白
    2.4 结果
        2.4.1 重组子 Tβ4 基因序列
        2.4.2 重组子转染到真核细胞
        2.4.3 Tβ4 mRNA 表达水平
        2.4.4 Western Blot 检测 Tβ4 蛋白
        2.4.5 Elisa 测定 Tβ4 蛋白
        2.4.6 细胞免疫荧光检测 Tβ4 蛋白
    2.5 讨论
第三章 α肌球蛋白重链启动子驱动报告载体构建及其应用
    3.1 前言
    3.2 材料
        3.2.1 基因载体、动物及细胞
        3.2.2 主要试剂
        3.2.3 主要仪器设备
    3.3 方法
        3.3.1 启动子 DNA 片段的扩增
        3.3.2 琼脂糖核酸电泳及 DNA 凝胶回收
        3.3.3 酶切及酶连
        3.3.4 质粒抽提及序列测定
        3.3.5 新生鼠心肌细胞的分离及培养
        3.3.6 BMSCs 的分离及培养
        3.3.7 报告载体转染到心肌细胞和 BMSCs
        3.3.8 BMSCs 向心肌诱导分化
        3.3.9 细胞免疫荧光检测心肌特异性
    3.4 结果
        3.4.1 报告载体鉴定的结果
        3.4.2 新生鼠心肌细胞及 BMSCs
        3.4.3 转染报告载体到心肌细胞及 BMSCs
        3.4.4 BMSCs 向心肌诱导分化
        3.4.5 细胞免疫荧光鉴定心肌特异性
    3.5 讨论
第四章 靶肽 MI1 表面修饰骨髓间充质干细胞
    4.1 前言
    4.2 材料
        4.2.1 动物
        4.2.2 主要试剂
        3.2.3 主要仪器设备
    4.3 方法
        4.3.1 BMSCs 的分离及培养
        4.3.2 BMSCs 的表面修饰
        4.3.3 MI1 对 BMSCs 生长的影响
        4.3.4 初步探究 MI1-BMSCs 在梗死心肌区域的分布
    4.4 结果
        4.4.1 BMSCs
        4.4.2 BMSCs 的表面修饰
        4.4.3 MI1 对 BMSCs 贴壁的影响
        4.4.4 MI1 对 BMSCs 传代的影响
        4.4.5 MI1-BMSCs 在梗死心脏中的分布
    4.5 讨论
第五章 全文结果汇总
第六章 结论与展望
参考文献
附录
在学期间发表的论文及科研成果清单
特别鸣谢
致谢



本文编号：3873667