E3泛素化连接酶cul4a通过特异性结合并调控PARP-1对抗氧化应激诱导的大鼠心肌细胞损伤的机制研究

发布时间：2024-03-20 06:01

　　目的:急性心肌梗死是心血管疾病死亡的重要原因之一,再灌注治疗是对其最好的治疗方法。即使许多再灌注的患者血液供应得到了恢复,但是心肌组织依然出现了损伤的进行性加重,这种损伤被称为缺血再灌注损伤。在缺血再灌注损伤诸多因素中,活性氧累积的氧化应激损伤是其核心。因此,通过对氧化应激损伤调控机制的探索,可以为治疗缺血再灌注损伤及其他氧化应激引起的心血管疾病提供新的策略。近年来,许多研究证实了泛素-蛋白酶体系统,尤其是E3泛素化连接酶在氧化应激损伤的调控中起到关键的作用,cul4a是近期发现的一种E3泛素化连接酶,与癌症有着密切的联系,广泛参与了细胞生理和病理过程。但是,目前尚没有研究表明cul4a是否参与到心血管系统疾病中,发挥怎样的生理功能和病理作用。因此,本研究拟应用体外心肌细胞实验,探讨cul4a在心肌细胞氧化应激损伤中的作用及分子机制。研究方法:选择H₂O₂作为H9c2心肌细胞氧化应激损伤的诱导因素,首先用50μM、100μM、200μM、400μM的H₂O₂处理2小时后,利用CCK-8-kit测定其...

【文章页数】：73 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
1 前言
2 材料与方法
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 细胞系
        2.1.2 抗体
        2.1.3 培养基、检测试剂盒和相关主要试剂
        2.1.4 实验溶液
        2.1.5 siRNA序列
        2.1.6 耗材
        2.1.7 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 质粒的构建
        2.2.2 siRNA的构建
        2.2.3 H9c2细胞的复苏、传代培养、冻存
        2.2.4 H9c2细胞氧化应激损伤的诱导
        2.2.5 H9c2 细胞系敲减cul4a
        2.2.6 H9c2 细胞中过表达cul4a
        2.2.7 细胞活力测定
        2.2.8 细胞免疫荧光
        2.2.9 AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术测定细胞凋亡
        2.2.10 Western Blot检测蛋白的表达量
        2.2.11 免疫共沉淀
        2.2.12 ROS荧光
        2.2.13 统计学分析
3 结果
    3.1 心肌细胞氧化应激损伤上调cul4a表达
    3.2 cul4a对 H₂O₂ 诱导的H9c2 心肌细胞氧化应激损伤的影响
        3.2.1 H9c2 心肌细胞过表达cul4a减轻H₂O₂ 诱导的氧化应激损伤
        3.2.2 H9c2 心肌细胞敲减cul4a加重H₂O₂ 诱导的氧化应激损伤
    3.3 cul4a的表达影响H₂O₂ 诱导的氧化应激损伤中ROS的变化
        3.3.1 H9c2 细胞内ROS水平随H₂O₂ 诱导的氧化应激损伤程度加重而上升
        3.3.2 H9c2 心肌细胞过表达cul4a降低H₂O₂ 诱导的氧化应激损伤中ROS的水平
        3.3.3 H9c2 心肌细胞敲减cul4a增加H₂O₂ 诱导的氧化应激损伤中ROS的水平
    3.4 H9c2 心肌细胞中cul4a与凋亡相关蛋白PARP-1 的相互作用
        3.4.1 免疫共沉淀实验确定PARP-1 作为E3 泛素化连接酶cul4a全新的结合蛋白与其相互作用
        3.4.2 在H₂O₂ 诱导的氧化应激损伤中,cul4a与 PARP-1 相互作用增强
    3.5 cul4a作为E3 泛素化连接酶可以降解PARP-1,减少其表达
        3.5.1 梯度过表达cul4a可以使PARP-1 表达水平逐渐降低
        3.5.2 敲减cul4a程度与PARP-1 表达水平增加正相关
4 讨论
5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历



本文编号：3933068