硒对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞线粒体自噬损伤的抑制作用

发布时间：2017-06-05 13:00

  本文关键词：硒对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞线粒体自噬损伤的抑制作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:当前心血管疾病成为所有致死原因的首位,而心血管疾病的发生、发展与血管内皮功能障碍密切相关。通过研究血管内皮功能来揭示心血管疾病的发病机制已成为重要的研究方法。线粒体自噬是当前研究热点,同型半胱氨酸(Hcy)已被证实是心血管疾病危险因子,同型半胱氨酸能否诱导内皮细胞线粒体自噬值得探索。现在研究发现高同型半胱氨酸血症(HHcy)患者常伴随高铜(Cu)血症,因此Hcy和Cu的联合作用对内皮细胞的影响值得探索。然而目前很多实验室所用血管内皮细胞传代过多、分化严重,对实验结果的说服性造成影响。本实验通过提取原代人脐静脉内皮细胞,初步探索同型半胱氨酸联合铜损伤血管内皮细胞线的机制,是否有粒体自噬参与,自噬是有利还是有害,而硒对可能发生的作用的干预作用。方法:(1)提取原代人脐静脉内皮细胞。从新生儿脐带提取脐静脉内皮细胞。(2)采用MTT法,检测不同浓度的Hcy、Cu、Se、Hcy+Cu及Hcy+Cu+Se对细胞增殖的影响。以硫酸铜溶液及亚硒酸钠溶液为铜离子及Se的来源,实验分为:(1)单纯Hcy对细胞增殖的影响,Hcy浓度分别为10μM、20μM、40μM、100μM、200μM;(2)单纯铜及单纯硒对细胞增殖的影响,Cu浓度分别为10μM、20μM、30μM、40μM、50μMμM;Se浓度分别为0.4μM、1μM、2μM、5μM、10μM;(3)加铜是否加重Hcy抑制增殖作用,各组合浓度为Hcy 40μM+Cu 10μM、Hcy 40μM+Cu 20μM、Hcy 40μM+Cu 30μM、Hcy 40μM+Cu40μM、Hcy40μM+Cu50μM;Hcy及Cu的处理时间均为48小时。(3)采用MTT法探索最适Se浓度。通过方法(2)中我们发现Hcy从40μM开始对细胞增殖产生了明显抑制,在该实验Cu及Se的限定浓度范围内,单纯加铜或单纯加硒对细胞增殖无明显影响,而在Hcy浓度为40μM时,加不同浓度的Cu加重了对细胞增殖的抑制作用。本实验选取Hcy 40μM+Cu 40μM作为人脐静脉内皮细胞损伤模型,通过加不同浓度硒来探讨硒的作用。实验分为正常对照组、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 0.4μM组、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 1μM组、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se2μM组、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 5μM组、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 10μM组。处理方法同(2)中。(4)细胞流式技术检测Hcy+Cu、Hcy+Cu+Se处理组ROS含量,探讨Se对ROS生成量的影响。采用DCFH-DA荧光探针、流式细胞仪技术检测活性氧。分为正常对照组、Hcy 40μM+Cu 40μM组、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 2μM组。(5)细胞流式技术检测Hcy+Cu、Hcy+Cu+Se处理组线粒体膜电位采用JC-1染料利用细胞流式技术检测线粒体膜电位,实验分为正常对照组、Hcy 40μM+Cu 40μM组、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 2μM组。(6)细胞流式技术检测Hcy+Cu、Hcy+Cu+Se处理组细胞凋亡率采用Annexin V法检测细胞凋亡率,实验分为正常对照组、Hcy 40μM+Cu 40μM组、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se 2μM组。(7)蛋白免疫印迹法检测LC3、PINK1蛋白表达量,探讨Hcy+Cu加重人脐静脉内皮细胞线粒体自噬的可能,以及Se的干预作用。实验分为正常对照组、Hcy 40μM+Cu 40μM组、Hcy 40μM+Cu 40μM+Se2μM组,Western-blot检测LC3级PINK1蛋白表达,探讨Hcu+Cu能否导致细胞自噬加重。结果:(1)成功提取原代人脐静脉内皮细胞。(2)40μM及以上的Hcy抑制细胞增殖,P0.05,且随Hcy浓度增加抑制作用提高,P0.05。Hcy和Cu的联合作用能加重细胞增殖的抑制作用。(3)0.4μM到5μM的Se对Hcy+Cu所致细胞增殖抑制具有减轻作用,P0.05;且硒的浓度为2μM时减轻抑制作用最明显,P0.05。(4)Hcy+Cu+Se组ROS含量较Hcy+Cu组低(P0.05),但较ctrl组高(P0.05)。(5)Hcy+Cu+Se组膜电位较Hcy+Cu组高(P0.05),但较ctrl组低(P0.05)。(6)Hcy+Cu+Se组凋亡率较Hcy+Cu组低(P0.05),但较ctrl组高(P0.05)。(7)Hcy+Cu+Se组LC3II/LC3I灰度值较Hcy+Cu组低(P0.05),但较ctrl组高(P0.05);Hcy+Cu+Se组PINK1灰度值较Hcy+Cu组低(P0.05),但较ctrl组高(P0.05)。结论:(1)同型半胱氨酸从40μM浓度开始能抑制人脐静脉内皮增殖,同型半胱氨酸浓度越高,细胞增殖抑制越显著;(2)Cu加重了同型半胱氨酸抑制人脐静脉内皮细胞增殖;(3)硒能减轻Cu和同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞增殖的影响,且较适合人脐静脉内皮细胞的硒浓度是2μM;(4)Cu和同型半胱氨酸损伤内皮细胞机制有线粒体自噬的参与,该自噬作用可能是过度而有害的,而硒可以减轻这一作用;(5)Cu和同型半胱氨酸可能通过增加细胞内ROS而经PINK1/Parkin途径介导了线粒体自噬过度的损害,而硒可能通过减少ROS的生成抑制了线粒体自噬过度。
【关键词】：硒 同型半胱氨酸 氧化应激 线粒体自噬
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文缩略词12-13
• 第1章 前言13-16
• 第2章 实验材料和方法16-30
• 2.1 实验材料16-18
• 2.1.1 实验细胞来源16
• 2.1.2 主要实验试剂和药品16-17
• 2.1.3 主要仪器17-18
• 2.2 实验方法18-29
• 2.2.1 相关溶液的配制18-21
• 2.2.2 原代人脐静脉内皮细胞提取过程及传代过程21-22
• 2.2.3 MTT法测细胞增值率22-24
• 2.2.4 细胞流式技术检测不同处理组活性氧ROS含量24
• 2.2.5 流式细胞仪JC-1 法线粒体膜电位的检测24-25
• 2.2.6 流式细胞仪Annexin V法检测细胞凋亡率25
• 2.2.7 Western-blot检测LC3、PINK1蛋白表达量25-29
• 2.3 统计学处理29-30
• 第3章 结果30-39
• 3.1 成功提取原代人脐静脉内皮细胞30
• 3.2 MTT法测细胞增值率30-33
• 3.2.1 Hcy、Hcy+Cu对人脐静脉内皮细胞增殖的影响，以及Se对此的干预30-33
• 3.2.2 Se对Hcy+Cu所致细胞增值率下降的保护以及最适硒浓度33
• 3.3 不同处理组活性氧ROS含量33-35
• 3.4 不同处理组线粒体膜电位35-36
• 3.5 不同处理组细胞凋亡检测结果36-37
• 3.6 Western-blot检测LC3、PINK1蛋白表达量结果37-39
• 第4章 讨论39-44
• 第5章 结论与展望44-45
• 5.1 结论44
• 5.2 进一步研究方向44-45
• 致谢45-46
• 参考文献46-51
• 综述 硒与心血管系统疾病51-58
• 参考文献56-58

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本文编号：423752