去乙酰化酶Sirt1调控缺氧心肌细胞线粒体融合与分裂的实验研究

发布时间：2017-06-27 20:00

  本文关键词：去乙酰化酶Sirt1调控缺氧心肌细胞线粒体融合与分裂的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:缺氧是许多心血管疾病共同的病理生理基础。随着缺氧程度和时间的增加,细胞出现代谢紊乱和功能障碍。线粒体是双层膜的细胞器,通过氧化磷酸化产生能量,在细胞代谢中发挥重要作用。在缺氧损伤作用下,作为细胞能量工厂的线粒体发生一系列变化,包括线粒体形态的改变。研究表明线粒体的形态影响细胞的功能,从钙离子信号到产生ROS、神经元的可塑性、肌肉萎缩、以及淋巴细胞的迁移。融合缺陷会引起线粒体功能异常,可能是由于融合缺陷的线粒体其进行线粒体基质交换的能力被削弱引起的。另一方面,阻断线粒体分裂会引起自噬介导的清除缺陷性线粒体被削弱,或者通过其他未知的功能来改变一些线粒体的功能。线粒体分裂和融合过程均由均由动力蛋白家族中大型GTP酶所介导。线粒体分裂由胞质动力蛋白家族成员动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)和分裂蛋白1(fission 1,Fis1)所介导。运用Fis1 RNAi或者Drp1的显性负性突变体抑制线粒体融合与分裂的周期,从而受损的线粒体材料不断积聚,进而导致代谢功能降低,说明抑制线粒体过度分裂具有重要意义。许多动物实验表明抑制线粒体分裂或者增加线粒体融合在组织缺血灌注、代谢性疾病和神经退行性疾病中都有重要的意义。既往研究发现Sirt1的表达缺失或者活性降低能够使心肌细胞凋亡增加,而其高表达在大鼠心肌缺血再灌注损伤中发挥保护作用。但Sirt1在缺氧心肌中的作用尚无详细报道。Sirt1调控线粒体增生、线粒体自噬,而后者与线粒体分裂与融合的变化密切相关。因此,我们推测:缺氧条件下,Sirt1可能通过调控线粒体融合与分裂,为心肌提供保护作用。目的:观察缺氧条件下线粒体融合与分裂的变化以及Sirt1在其中的影响及其可能的机制。方法:1.临床上收集于2014年1月-2014年12月之间在第三军医大学新桥医院心外科行手术治疗的先心病患者,其中紫绀组15例,非紫绀组14例,取术中所切除的右室流出道肥厚的心肌组织为心肌标本,运用免疫印迹(Western Blot)检测Drp1与Fis1蛋白表达情况。2.缺氧环境下培养H9c2心肌细胞。提取不同缺氧时间节点的心肌细胞总蛋白,Western blot检测Drp1与Fis1蛋白表达水平变化。线粒体靶向质粒mt RFP转染H9c2细胞,观察缺氧条件下线粒体形态的变化。3.缺氧条件下,DRP1K38A质粒和h Fis1质粒分别转染至H9c2细胞,空白质粒组做对照,LDH试剂盒检测心肌细胞毒性。4.将线粒体靶向质粒分别同空载质粒、Sirt1干扰质粒和Sirt1过表达质粒共转染至H9c2细胞,于常氧或缺氧条件下培养12h后,激光共聚焦显微镜下观察线粒体融合、分裂变化情况。5.运用腺病毒Ad-Sirt1和慢病毒Lv-Sh-Sirt1分别在H9c2细胞中过表达或干扰Sirt1后,Ad-GFP组和Lv-scramble组为相应的对照组,缺氧培养箱中培养12h,Western blot法检测各组Drp1与Fis1表达水平。结果:1.紫绀组先心病患者心肌细胞中Drp1与Fis1表达显著高于非紫绀组(P值均小于0.05);Western blot结果表明缺氧条件下培养的H9c2细胞中Drp1与Fis1的蛋白表达随缺氧的时间的延长而上升。线粒体形态分析表明,与常氧组相比,缺氧能够诱导线粒体分裂[(64±5.29%)vs(12.33±3.51%),P0.05]。抑制缺氧条件下的线粒体分裂能够提高心肌细胞的存活。2.激光共聚焦结果表明,Sirt1过表达后,缺氧诱导的线粒体分裂显著降低(P0.05),而当Sirt1受到干扰后,缺氧诱导的线粒体分裂水平增强(P0.05);同时,Sirt1过表达能够降低缺氧诱发的H9c2心肌细胞的死亡率。在缺氧培养条件下,同对照组相比,过表达Sirt1能够降低Drp1与Fis1蛋白表达(P0.05),而当Sirt1被抑制后,Drp1与Fis1蛋白表达增加(P0.05)。结论:缺氧条件下,Sirt1可能通过抑制促线粒体分裂蛋白Drp1与Fis1的表达进而抑制缺氧诱导的线粒体分裂,对缺氧心肌起到保护作用。
【关键词】：沉默信息调节因子2相关酶1 动力相关蛋白1 分裂蛋白1 线粒体融合与分裂 缺氧
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-10
• 第一章 前言10-12
• 第二章 促线粒体分裂蛋白Drp1与Fis1在紫绀型先心病患者心肌组织与缺氧心肌细胞中表达情况的研究12-23
• 2.1 材料和方法12-18
• 2.2 结果18-21
• 2.3 讨论21-22
• 2.4 小结22-23
• 第三章 Sirt1对缺氧条件下心肌细胞线粒体融合与分裂的影响23-30
• 3.1 材料与方法23-25
• 3.2 结果25-28
• 3.3 讨论28-29
• 3.4 小结29-30
• 全文结论30-31
• 参考文献31-34
• 文献综述 线粒体融合与分裂在心血管疾病中的作用及其研究进展34-44
• 参考文献40-44
• 研究生在读期间发表的论文44-45
• 致谢45

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