miR-134靶向沉默ANGPTL4对巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应的影响及机制

发布时间：2017-07-01 09:02

  本文关键词：miR-134靶向沉默ANGPTL4对巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应的影响及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是一种脂质代谢紊乱和炎症反应等多种机制相互作用而产生的慢性炎症性疾病,其中巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应是其发病的两个关键因素。脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是脂肪酶基因家族中可以水解甘油三脂的核心限速酶,而巨噬细胞中LPL则可以介导巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子表达,从而促进泡沫细胞形成及As的发生发展。血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like 4,ANGPTL4)是血管生成素样蛋白家族的成员之一,越来越多的研究表明ANGPTL4可以抑制LPL活性,过表达巨噬细胞中ANGPTL4可以降低巨噬细胞脂质蓄积和泡沫细胞形成。近年来研究发现越来越多的micro RNA可以通过多种脂质代谢信号途径参与As的发生发展。最新研究显示miR-134与心肌梗死等心血管疾病密切相关,He等人在动脉硬化患者的血管内膜、血浆和巨噬细胞中发现miR-134是高表达的,提示miR-134促进As的发生发展,但机制尚不明确。通过生物信息学软件分析我们发现miR-134具有靶向结合ANGPTL4的生物学基础,本研究目的旨在探讨miR-134在动脉粥样硬化发生发展中的作用和机制,为防治As提供新的研究策略和治疗靶点。[方法]利用多种生物信息学Micro RNA相关网站预测各物种miR-134序列、保守性、miR-134靶标基因、与ANGPTL4结合位点、靶标结合评分、茎环结构和自由能评分等。采用双荧光素酶报告基因法验证miR-134与ANGPTL4 3’UTR具有靶向结合作用。THP-1巨噬细胞转染不同浓度(0,10,20,40,80 n M)和不同时间(0、6,12,24,48 h)后,Western blot检测ANGPTL4蛋白水平,实时定量PCR法检测ANGPTL4 m RNA水平。利用LPL活性试剂盒检测miR-134 mimic对巨噬细胞中LPL活性的影响,采用TG试剂盒和HPLC检测miR-134 mimic对细胞内TG及TC、FC和CE的含量的影响,还检测miR-134对巨噬细胞中介导脂质摄取的受体SR-A和CD36表达影响以及LPL和LRP-1结合情况。观察miR-134 mimic等对巨噬细胞炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10分泌的影响。[结果]生物信息学预测结果显示miR-134在不同物种进化中高度保守,多个靶标预测网站预测预测综合评分较高,这些结果显示miR-134具有靶向结合ANGPTL4的生物学作用。细胞转染ANGPTL4野生型和突变型3’UTR后,miR-134组与对照组相比双荧光素酶活性明显降低,而突变型3’UTR组双荧光素酶活性明显增加,证实miR-134靶向结合ANGPTL4的生物学。miR-134还呈剂量和时间依赖性下调巨噬细胞中ANGPTL4表达,上调LPL表达和活性,上调巨噬细胞SR-A和CD36受体的表达和LPL和LRP-1结合,增加巨噬细胞脂质蓄积。miR-134 mimic还可以上调促炎因子TNF-α、MCP-1、IL-6分泌,下调抑炎因子IL-10分泌,而miR-134 inhibitor则逆转这些因子的分泌情况。[结论]miRNA-134靶向沉默ANGPTL4后,上调巨噬细胞中LPL所介导的脂质蓄积和炎症反应,从而促进动脉粥样硬化的发生发展。
【关键词】：微小RNA-134 血管生成素样蛋白4 脂质蓄积 炎症反应
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 第1章 绪论13-19
• 第2章 实验材料19-25
• 2.1 主要实验试剂19-21
• 2.2 miRcroRNA公共数据库及在线软件21-22
• 2.3 主要实验器材与实验仪器22-25
• 第3章 实验方法25-33
• 3.1 生物信息学预测25-27
• 3.2 细胞培养27
• 3.3 细胞换液27-28
• 3.4 实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR）分析28
• 3.5 酶联免疫吸附法28
• 3.6 细胞蛋白抽提与蛋白质印迹检测（Western blotting）28-29
• 3.7 小分子干扰（siRNA）转染29
• 3.8 双荧光素酶报告基因构建与分析29-30
• 3.9 瞬时转染30
• 3.10 LPL活性检测30-31
• 3.11 高效液相色谱法（HPLC）31
• 3.12 免疫共沉淀分析（Ch IP）31
• 3.13 统计分析31-33
• 第4章 实验结果33-49
• 4.1 生物信息学预测结果33-36
• 4.2 miR-134 与ANGPTL4靶向结合作用36-37
• 4.3 miR-134 对巨噬细胞ANGPTL4表达的影响37-39
• 4.4 miR-134 对巨噬细胞LPL表达及活性的影响39-42
• 4.5 miR-134 对巨噬细胞脂质蓄积的影响42-44
• 4.6 miR-134 对THP-1 巨噬细胞SR-A和CD36表达的影响44-45
• 4.7 miR-134 对巨噬细胞炎症因子分泌的影响45-47
• 4.8 miR-134 对LPL与LRP-1 结合的影响47-49
• 第5章 讨论49-53
• 第6章 结论53-55
• 参考文献55-59
• 文献综述59-71
• 参考文献67-71
• 攻读学位期间发表论文71-73
• 致谢73-75
• 资金资助75

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