热休克蛋白70碳末端反应蛋白（CHIP）参与高糖诱导的心肌损伤

发布时间：2017-07-01 07:08

  本文关键词：热休克蛋白70碳末端反应蛋白（CHIP）参与高糖诱导的心肌损伤，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:大量研究表明热休克蛋白70碳末端反应蛋白(CHIP)在细胞损伤、凋亡、热应激等方面起非常重要的作用。本次研究探讨CHIP在高糖诱导的心肌损伤中的作用,假设通过敲减CHIP在心肌细胞的表达可加重高糖诱导的心肌细胞损伤。方法:1、提取原代心肌细胞后分为6个实验组:低糖(LG)组,高糖(HG)组,低糖+病毒(CHIP+LG)组,高糖+病毒(CHIP+HG)组,低糖+空病毒(LV-NC+LG)组,高糖+空病毒(LV-NC+HG)组;应用LV-CHIP-RNAi和LV-NC慢病毒转染原代心肌细胞;高糖培养应用25.5mmol/L葡萄糖浓度培养24h,低糖培养应用5.5mmol/L葡萄糖浓度培养24h。2、检测各组上清液中LDH的活性;ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6的表达;Annexin V-PE/7-AAD试剂盒检测细胞凋亡;qRT-PCR法检测CHIP、Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA水平。结果:1、在显微镜下,体外培养的心肌细胞,形态呈现不规则多边形,培养72小时后大部分细胞融合生长,全屏视野内大部分细胞搏动,搏动频率约为60次/分。通过荧光显微镜观察,在转染慢病毒72小时后,可见荧光表达最强,显示60%以上的心肌细胞表达绿色免疫荧光。2、各实验结果:1)HG组和LG组相比:LDH活性升高;炎症因子IL-1β、IL-6含量升高;心肌凋亡率升高;CHIP mRNA、Bax mRNA、Caspase3 mRNA水平上调,Bcl-2mRNA水平下调。2)LV-NC+LG组和LG组、LV-NC+HG组和HG组相比:LDH活性、IL-1β、IL-6含量、心肌凋亡率无明显差别;Bax m RNA、Bcl-2 mRNA、Caspase3 mRNA的水平无明显改变。3)CHIP+HG组和LV-NC+HG组相比:LDH活性明显升高;IL-1β升高,IL-6明显升高;心肌凋亡率显著升高;Bax m RNA、Caspase3 mRNA水平显著上调,Bcl-2 mRNA水平显著下调。结论:1、高糖培养上调心肌细胞CHIP mRNA水平。2、高糖培养可诱导心肌凋亡及炎症。3、敲减CHIP基因能加重高糖诱导的心肌凋亡及炎症。
【关键词】：CHIP 心肌细胞 高糖 损伤 炎症 凋亡
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第1章 引言10-12
• 第2章 材料与方法12-23
• 2.1 实验材料12-13
• 2.1.1 实验动物12
• 2.1.2 主要试剂及耗材12-13
• 2.1.3 主要仪器13
• 2.2 实验方法13-22
• 2.2.1 实验器材的准备13-14
• 2.2.2 相关液体的配制14-15
• 2.2.3 心肌细胞的提取及培养15-16
• 2.2.4 实验分组16-17
• 2.2.5 LV-CHIP-RNAi慢病毒载体和LV-NC慢病毒载体转染心肌细胞17-18
• 2.2.6 检测各组心肌细胞LDH活力18-19
• 2.2.7 ELISA法检测各组细胞IL-1β、IL-619-20
• 2.2.8 荧光定量PCR检测各组心肌细胞CHIP及凋亡基因Bax、Bcl-2、Caspase 3mRNA的表达20-21
• 2.2.9 Annexin V-PE/7-AAD法检测细胞凋亡21-22
• 2.3 统计学分析22-23
• 第3章 结果23-34
• 3.1 心肌细胞的生长特点23-24
• 3.2 高糖培养上调CHIP mRNA的表达24-25
• 3.3 LV-CHIP-RNAi慢病毒载体和LV-NC空载慢病毒载体转染心肌细胞的结果25-26
• 3.4 特异性慢病毒下调CHIP mRNA的表达26-27
• 3.5 检测各组LDH活力27
• 3.6 检测各组炎症因子IL-1β、IL-6 的表达27-29
• 3.7 检测各组凋亡因子Bax、Bcl-2、Caspase3 mRNA的表达29-32
• 3.7.1 检测基因Bax mRNA的水平29-30
• 3.7.2 检测基因Bcl-2 mRNA的表达30-31
• 3.7.3 检测基因Caspase3 mRNA的表达31-32
• 3.8 检测各组细胞凋亡率32-34
• 第4章 讨论34-38
• 第5章 结论与展望38-39
• 5.1 结论38
• 5.2 展望38-39
• 致谢39-40
• 参考文献40-43
• 综述43-48
• 参考文献47-48

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