沉默HO-1增强低浓度5-氮杂胞苷诱导SKM-1细胞凋亡的作用及机制研究

发布时间：2017-07-02 04:15

  本文关键词：沉默HO-1增强低浓度5-氮杂胞苷诱导SKM-1细胞凋亡的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨慢病毒介导小干扰RNA沉默HO-1增强低浓度5-氮杂胞苷诱导SKM-1细胞凋亡的作用及其机制。方法:Real-time PCR检测MDS/AML细胞株在5-氮杂胞苷加药前后以及MDS患者(n=48)骨髓血单个核细胞HO-1基因表达;经慢病毒介导小干扰RNA转染SKM-1细胞以沉默HO-1基因表达,并分组为空白组、空载体组、沉默HO-1组,三组细胞分别予以5-氮杂胞苷、Hemin联合5-氮杂胞苷处理;MTT法检测调控HO-1表达后,低浓度5-氮杂胞苷对SKM-1细胞生长抑制的影响;流式细胞术检测调控HO-1表达后,低浓度5-氮杂胞苷对SKM-1细胞凋亡及周期的影响;Real-time PCR检测调控HO-1表达后,DNMT1、p16及p16下游相关周期基因(CDK4、CDK6、CyclinD1、p21、p27、p57、RB及E2F1)表达;Western blot进一步分析p16下游相关周期蛋白(CDK4、CDK6、CyclinD1、pRB、E2F1及p27)及凋亡蛋白(Caspase-3、Cleaved caspase-3、BCL-2及Bax)表达;甲基化特异性PCR分析调控HO-1表达后,p16基因启动子的甲基化程度的改变;建立空白组、空载体组、沉默HO-1组SKM-1细胞NOD/SCID小鼠血液肿瘤模型,并分别予以生理盐水或5-氮杂胞苷治疗,记录其体重变化及生存时间,瑞氏染色检测荷瘤小鼠外周血SKM-1细胞,流式细胞术检测荷瘤小鼠外周血人CD45+SKM-1细胞比例。结果:SKM-1细胞在经5-氮杂胞苷作用后,HO-1基因表达增加(P0.05),且高危组与极高危组MDS患者骨髓血单个核细胞HO-1表达较低危组增高(P0.05);MTT结果显示,5-氮杂胞苷以浓度依赖性方式抑制SKM-1细胞生长,而沉默HO-1后,SKM-1细胞的生长抑制率较空白组和空载体组均增加(P0.05),而经Hemin上调HO-1表达则明显减弱5-氮杂胞苷诱导的SKM-1细胞生长抑制效应;流式细胞术结果显示,沉默HO-1表达后,5-氮杂胞苷诱导的SKM-1细胞凋亡率由空载体组:28.08%±0.04增加到48.64%±0.09(P0.05),而经Hemin联合5-氮杂胞苷处理后,空载体组、沉默HO-1组凋亡率则分别下降为15.95%±0.04、31.43%±0.07,且沉默HO-1促进5-氮杂胞苷诱导的SKM-1细胞凋亡依赖于Caspase-3凋亡途径;沉默HO-1表达后,5-氮杂胞苷诱导的SKM-1细胞G0/G1期阻滞由空载体组:30.03%±0.05增加到59.39%±0.11(P0.05),而经Hemin联合5-氮杂胞苷处理后,空载体组、沉默HO-1组SKM-1细胞G0/G1期比例均分别下降为21.58%±0.03、39.29%±0.04;Real-time PCR结果显示,在5-氮杂胞苷加药的情况下,与空载体组相比,沉默HO-1组SKM-1细胞DNMT1表达明显减弱,p16表达显著增加,p16下游周期相关基因CDK4、CDK6、RB、E2F1表达减低,p27表达增加(P0.05);Western blot结果显示,在5-氮杂胞苷加药的情况下,与空载体组相比,沉默HO-1组SKM-1细胞p16表达增加,p16下游周期蛋白CDK4、CDK6、pRB、E2F1表达减低,p27表达增加(P0.05),同时,凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Bax表达增加及BCL-2表达减低(P0.05);甲基化特异性PCR结果显示,沉默HO-1显著增加5-氮杂胞苷诱导的p16基因启动子去甲基化水平(P0.05),而经Hemin上调HO-1表达则可以减弱AZA诱导的p16基因启动子去甲基化作用;体内研究表明,与5-氮杂胞苷治疗的空载体组荷瘤小鼠相比,经5-氮杂胞苷治疗的沉默HO-1组荷瘤小鼠体重减轻程度降低,生存时间延长,小鼠外周血SKM-1细胞数量明显减少,小鼠外周血人CD45+SKM-1细胞比例显著减低(P0.05)。结论:沉默HO-1增强5-氮杂胞苷对SKM-1细胞的生长抑制、细胞凋亡及细胞周期阻滞效应,其机制可能与沉默HO-1促进5-氮杂胞苷对p16基因去甲基化作用相关,同时,Cleaved caspase-3凋亡分子表达增加、BCL-2/Bax比值降低。因此,HO-1可能是增强AZA治疗MDS转化为AML的靶点之一,这为临床治疗高危MDS提供新思路。
【关键词】：骨髓增生异常综合征 SKM-1 5-氮杂胞苷 HO-1 p16
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R551.3
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 略缩词表9-10
• 引言10-11
• 材料与方法11-25
• 结果25-40
• 讨论40-44
• 结论44-45
• 参考文献45-49
• 综述49-61
• 参考文献55-61
• 作者简历61-62
• 致谢62-63
• 学位论文数据集63

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