hAIF-1重组腺病毒对A549细胞增殖和迁移的影响

发布时间：2017-07-16 21:04

  本文关键词：hAIF-1重组腺病毒对A549细胞增殖和迁移的影响

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【摘要】：AIF-1是一个大小为17kDa,位于细胞质中的钙离子结合蛋白,包含2个EF-手形结构域,能够结合并聚合肌动蛋白,在自然界中AIF-1的丰度不高,所以想要分离得到大量天然的表达产物困难较大。已有研究证实AIF-1能够促进血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞以及乳腺癌细胞等多种细胞的增殖和迁移,进而影响相关疾病的发生和发展,AIF-1与细胞分化之间关系的研究较少发现。本实验将人AIF-1cDNA克隆到原核表达载体,并用IPTG进行诱导表达,纯化AIF-1原核表达蛋白,初步研究AIF-1对人肺细胞株A549增殖和迁移的影响,并首次探讨了AIF-1与小鼠成肌细胞C2C12分化的相关性。依据人AIF-1基因序列,设计引物,将人AIF-1 cDNA克隆到pET-28a(+)载体,构建pET-28a(+)-hAIF-1原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)感受态细菌诱导表达,收集菌体,SDS-PAGE电泳及Western Blot分析蛋白表达。超声破碎菌体,分析蛋白的可溶性并纯化收集AIF-1蛋白。结果显示,pET-28a(+)-hAIF-1质粒经1：mM IPTG诱导4h后,PAGE电泳检测在约20kDa处有一条明显条带,说明重组蛋白主要以可溶性形式存在,镍柱纯化后得到纯度较高的AIF-1蛋白。构建穿梭质粒pDC315-EGFP-hAIF-1将穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxdeltaE13Cre共转染293细胞包装腺病毒,获得表达人AIF-1基因的重组腺病毒,TCID50法测定病毒滴度,用所制备的重组腺病毒感染A549细胞,RT-PCR和Western Blot鉴定A549细胞中AIF-1表达状态,MTT法检测细胞增殖,细胞划痕和Transwell实验检测细胞迁移。结果表明,成功构建了表达AIF-1基因的重组腺病毒,所得病毒滴度为2.5×108pfu/ml;用AIF-1重组腺病毒感染人A549细胞,RT-PCR和Western Blot鉴定显示细胞能够过表达AIF-1; MTT显示过表达AIF-1可显著增强A549细胞增殖能力；细胞划痕和Tranwell实验证明过表达AIF-1能够促进A549细胞迁移。用2%的马血清培养基诱导C2C12细胞分化,以肌球蛋白重链(MHC)的表达作为细胞分化指标,Western Blot和Q-PCR检测细胞分化过程中AIF-1的表达情况。结果发现,在诱导第3天MHC开始表达,C2C12细胞融合形成肌管,之后肌管不断增加变粗,MHC表达也逐渐增加,在整个诱导分化过程中,AIF-1的表达在蛋白水平上呈上升趋势,但在mRNA水平上呈下降趋势,说明C2C12细胞的分化会影响AIF-1的表达。
【关键词】：AIF-1 原核表达 腺病毒 增殖 迁移 分化
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文缩写词表6-9
• 第1章 综述9-19
• 1.1 同种异体移植物炎症因子-1(AIF-1)9-13
• 1.1.1 AIF-1的发现及其类似物9
• 1.1.2 AIF-1基因定位及蛋白特性9-11
• 1.1.3 AIF-1的表达及主要生物学功能11-13
• 1.1.3.1 AIF-1的表达11
• 1.1.3.2 AIF-1与细胞增殖11-12
• 1.1.3.3 AIF-1与细胞迁移12-13
• 1.2 大肠杆菌表达系统13
• 1.3 腺病毒载体13-17
• 1.3.1 腺病毒的一般特性13-14
• 1.3.2 腺病毒载体的研究进展14-17
• 1.4 C2C12细胞的分化17
• 1.5 本实验研究内容及意义17-19
• 第2章 hAIF-1基因克隆及原核表达19-31
• 2.1 实验材料19-21
• 2.1.1 菌株及质粒19
• 2.1.2 主要试剂及耗材19
• 2.1.3 主要实验仪器19-20
• 2.1.4 主要试剂配制20-21
• 2.2 实验方法21-24
• 2.2.1 hAIF-1基因的克隆(TA克隆)21-22
• 2.2.2 pET-28a(+)-hAIF-1质粒构建22
• 2.2.3 重组质粒的原核表达及鉴定22-23
• 2.2.4 重组蛋白的可溶性分析和蛋白纯化23-24
• 2.2.5 数据处理24
• 2.3 实验结果24-29
• 2.3.1 hAIF-1基因的克隆24-26
• 2.3.2 pET-28a(+)-hAIF-1质粒构建26-27
• 2.3.3 重组质粒的原核表达及鉴定27-28
• 2.3.4 重组蛋白的可溶性分析和蛋白纯化28-29
• 2.4 讨论29-31
• 第3章 hAIF-1基因重组腺病毒的构建及其对A549细胞增殖和迁移的影响31-48
• 3.1 实验材料31-33
• 3.1.1 菌株、质粒及细胞31
• 3.1.2 主要试剂及耗材31
• 3.1.3 主要实验仪器31-32
• 3.1.4 主要试剂配制32-33
• 3.2 实验方法33-39
• 3.2.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备33
• 3.2.2 腺病毒穿梭质粒pDC315-EGFP-hAIF1的构建33-34
• 3.2.3 质粒的大量制备34-35
• 3.2.4 重组腺病毒的包装35-36
• 3.2.5 PCR鉴定重组病毒36
• 3.2.6 重组腺病毒的扩增36
• 3.2.7 重组腺病毒滴度的测定36-37
• 3.2.8 RT-PCR和Western Blot分析hAIF-1在A549细胞中的表达37-38
• 3.2.9 腺病毒感染A549细胞的增殖实验38-39
• 3.2.10 腺病毒感染A549细胞的划痕实验39
• 3.2.11 腺病毒感染A549细胞的Transwell实验39
• 3.2.12 实验数据处理39
• 3.3 实验结果39-45
• 3.3.1 hAIF-1重组腺病毒穿梭质粒的构建39-40
• 3.3.2 hAIF-1重组腺病毒的包装40-41
• 3.3.3 hAIF-1重组腺病毒鉴定41-42
• 3.3.4 hAIF-1重组腺病毒滴度的测定42
• 3.3.5 RT-PCR和Western Blot分析hAIF-1在A549细胞中的表达42
• 3.3.6 hAIF-1重组腺病毒对A549细胞增殖的影响42-43
• 3.3.7 hAIF-1重组腺病毒感染A549细胞的划痕实验43-44
• 3.3.8 hAIF-1重组腺病毒感染A549细胞的Transwell实验44-45
• 3.4 讨论45-48
• 第4章 AIF-1在C2C12细胞分化过程中的表达48-53
• 4.1 实验材料48
• 4.2 实验方法48-49
• 4.2.1 小鼠成肌细胞C2C12分化模型的建立48
• 4.2.2 C2C12细胞分化过程中AIF-1表达状态分析48-49
• 4.2.3 实验数据处理49
• 4.3 实验结果49-51
• 4.3.1 小鼠成肌细胞C2C12分化模型的建立49-50
• 4.3.2 C2C12细胞分化过程中AIF-1表达状态分析50-51
• 4.4 讨论51-53
• 全文总结53-54
• 参考文献54-59
• 致谢59

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