Calpains在心肌细胞生长中的作用

发布时间：2017-07-20 15:19

  本文关键词：Calpains在心肌细胞生长中的作用

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【摘要】：【背景】心力衰竭是心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的重要死亡原因之一。由心脏压力超负荷引起的心肌代偿性肥大并向心力衰竭转化,严重制约着CVD的防治效果,但其转化机制至今仍未完全阐明。探寻压力超负荷下,肌原纤维横向加入的详细过程,有助于理解肥厚心肌向心力衰竭转化的机制。已有研究表明心肌细胞连接结构闰盘在这一过程中起着重要作用,过渡连接和编织假说的提出较好地解释了新生肌节的纵向加入,但肌原纤维横向加入机制迄今仍未阐明。肌原纤维组成蛋白处于不断合成组装和降解的动态平衡之中,这两方面都可被增加的心脏工作负荷所激活。Calpains是一类钙依赖性的中性蛋白水解酶,calpastatin是其特异性内源性抑制剂,calpains参与了肌原纤维蛋白的降解更新及其细胞骨架的重塑,且在心肌细胞肥大时表达水平增加,推测其在心肌细胞生长性肥大中亦起着重要作用。在大鼠的生长发育过程中,随着心脏容积和压力负荷的增加,心肌细胞不断增长增宽,本实验以大鼠出生后的生长发育过程为模型,探寻建立肌原纤维横向加入模型以及calpain系统在其中的作用。【目的】以新生大鼠为研究对象,观测出生后心脏生长发育过程中,肌原纤维和闰盘结构之间的关系,建立肌原纤维横向加入模型,同时探寻calpains系统心肌闰盘重塑及肌节生长中的可能作用。【方法】在大鼠出生后第1、2、3、4、5、6、7、9、11、14、28、90天,称量大鼠体重及心重。采用免疫组化方法,以Ki67标记增殖细胞核,麦胚凝集素鉴别细胞核来源,计算各观测点心肌细胞增殖率,确定大鼠出生后心肌快速生长的观测时间范围。然后采用透射电镜定性与定量观测心肌组织超微结构,构建肌原纤维从闰盘处横向加入模型。在此基础上,利用Western blot技术、免疫组织化学荧光技术与免疫金标电镜技术,检测心肌闰盘黏着连接跨膜蛋白N-cadherin(N-cad)和缝隙连接跨膜蛋白connexin 43(CX43),以及calpain-1、calpain-2和calpastatin蛋白表达水平的动态变化,同时观测并确认calpain-2与calpastatin在闰盘处的定位,分析N-cad、Desmoglein-2(DSG-2,桥粒跨膜蛋白之一)和CX43的共定位关系与迁移规律,calpain-2与calpastatin在闰盘重塑过程中的作用。【结果】1建立肌原纤维在闰盘处横向加入而使心肌细胞增宽的模型Ki67蛋白标记检测结果表明:在大鼠出生后第7天,心肌细胞增殖速率降至较低水平(6.76%±1.14%),结合大鼠心重与体重数据,我们确立观察时间点为大鼠出生后第7至90天,其中大鼠出生的第7到28天为心脏的快速生长期,第90天作为心脏相对生长成熟的对照点。肌原纤维的宽度分布及其定量分析表明,存在着基本(最小)宽度单位的肌原纤维,我们称之为初级肌原纤维。心肌细胞中的初级肌原纤维大部分分布于细胞膜下;统计分析表明,出生后第7天位于心肌细胞膜下的初级肌原纤维百分比为48.53%±0.93%,第14天为49.69%±2.51%,第28天为36.84%±0.27%,至出生后第90天,其百分比迅速降低至4.86%±0.12%。这提示心肌细胞膜下的初级肌原纤维可能为新生的肌原纤维。另一方面,在各个观测时间点心肌细胞超微结构上,均可见初级肌原纤维融合为成熟肌原纤维的现象。在大鼠出生后的第7到90天,在相邻两个心肌细胞的Z盘处,可见与心肌细胞纵轴平行的闰盘,形态与桥粒类似,缺乏肌丝附着,称之为平行闰盘。还可见有初级肌原纤维附着的斜行闰盘,以及垂直于心肌细胞纵轴,形成一个褶皱且与初级肌原纤维连接的初级横行闰盘。另外则是在成熟心肌细胞上常见的闰盘,即成熟横行闰盘,这种闰盘形成数个波浪状结构,大约0.2~0.5mm宽,成熟肌原纤维与之相连接;亦可见到波浪的峰谷距离增宽至2.0mm的成熟闰盘。定量分析表明:闰盘波浪数目与肌原纤维宽度呈正线性相关。大鼠出生后第7至90天,心肌细胞平行闰盘百分比逐渐降低(第7天为30.81%±0.29%,第14天为18.03%±0.52%,第28天为14.99%±0.33%,第90天为6.14%±0.38%),初级与成熟横行闰盘百分比逐渐升高(第7天为28.45%±1.20%,第14天为42.50%±0.69%,第28天为45.52%±0.89%,第90天为76.66%±0.71%);在第7到28天,斜行闰盘百分比基本保持不变(第7天为40.75%±1.02%,第14天为39.47%±0.91%,第28天为38.49%±0.57%),到第90天呈显著性降低(17.20%±0.33%)。这些数据提示,闰盘的发育成熟过程可能是平行闰盘转变成斜行闰盘,斜行闰盘进一步转变成初级横行闰盘,最后形成成熟横行闰盘。基于上述肌原纤维与闰盘同步生长的实验数据,我们提出肌原纤维在闰盘处横向加入,使心肌细胞宽度增加的新模型:即在心肌细胞生长时,邻近两个心肌细胞的Z盘或过渡连接(transitional junction)处生成平行闰盘,随着附着初级肌原纤维,在纵轴向应力作用下,平行闰盘转变为斜形闰盘,接着,心肌细胞端-端两侧肌原纤维的对称生成,使闰盘形成一个褶皱,成为初级横行闰盘,依此模式不断横向增加初级横行闰盘,伴随着初级肌原纤维的融合,逐步形成成熟的肌原纤维与闰盘。2心肌发育过程中,闰盘跨膜结构蛋白的动态变化特征在心肌生长发育过程中,N-cad的表达水平逐渐增加;CX43表达水平先逐渐增高,至第14天达峰值,然后逐步降低至一个稳定水平。出生后第1天,N-cad、DSG-2与CX43在细胞膜呈弥散分布;第7天时N-cad与DSG-2在心肌细胞长轴两端集聚,CX43亦有少量集聚,标示闰盘形成。从第14天到90天,三种蛋白在闰盘处集聚逐步增多;而在侧面的分布表现出一种相反的趋势:N-cad与DSG-2在细胞侧面的分布大幅减少,CX43虽在细胞侧面的分布降低,但至90天仍有CX43分布于细胞侧面。采用体视学方法进行定量分析表明,在出生第1天,N-cad与DSG-2总的共定位为33.5%;第7天总共定位升高为38.6%,其中闰盘处共定位占9.4%,细胞侧面共定位为29.2%。从第14天到90天,随着N-cad与DSG-2总共定位增加至65.7%,在闰盘处的共定位亦增加到60.5%,在细胞侧面的共定位却降低至5.2%。N-cad与CX43的总共定位从第1天的10.3%,逐步增加到第90天的37.1%;在闰盘处的共定位逐步增加,而细胞侧面的共定位保持在5%左右。DSG-2与CX43共定位特征及百分比类似于N-cad与CX43。N-cad与DSG-2共定位百分比明显高于N-cad与CX43或DSG-2与CX43的共定位。上述结果提示,大鼠在出生后的心肌发育过程中,构成细胞力学连接的N-cad与DSG-2先于构成细胞电化学连接的CX43在闰盘处集聚,即心肌细胞生长需形成稳定的力学环境。这些结果从另一角度印证了上述肌原纤维横向加入模型,即先形成力学结构的桥粒与黏着连接。3 Calpain系统在闰盘形成过程中,既发挥稳定作用,亦是塑形的重要工具免疫组化与免疫金标电镜观测证实:在心肌细胞闰盘处存在calpain-2和calpastatin的定位。随着大鼠心肌的生长发育,calpastatin蛋白表达水平逐渐升高,calpain-2蛋白表达水平逐渐降低,至出生后第90天,calpastatin或calpain-2蛋白表达水平显著高于或低于第1天表达水平。免疫组织化学观察发现,在心肌细胞纵轴末端处,calpastatin的定位更加早于N-cad和DSG-2,而calpain-2的定位则在N-cad和DSG-2之后;在心肌生长发育过程中,闰盘处calpastatin与N-cad的共定位程度逐渐增高(第7天为36.45%±0.68%,第14天为44.54%±0.84%,第28天为47.41%±1.49%。第90天为88.48%±0.42%),而calpain-2与N-cad的共定位程度逐渐降低(第7天为84.45%±0.99%,第14天为79.02%±1.79%,第28天为75.93%±1.37%。第90天为32.29%±1.93%)。因calpastatin为calpains的内源性抑制物,这些结果提示N-cadherin和DSG-2在闰盘处的组装,可能需要calpastatin首先提供一个稳定的化学环境,而calpain-2则发挥不断重塑闰盘的作用。【结论】本研究结果表明:在心肌细胞生长发育过程中,初级肌原纤维在斜行闰盘处加入,初级肌原纤维融合形成成熟肌原纤维,斜行闰盘转化为成熟的闰盘,从而使心肌细胞不断增宽。这一过程的分子机制可能涉及下列环节:calpastatin最先在心肌细胞纵轴两端集聚,形成稳定的化学环境,接着桥粒与黏着连接蛋白在两端处集聚与装配,calpain-2可能参与桥粒/黏着连接的装配塑形过程,最终形成成熟的闰盘,细胞膜弥散分布的闰盘结构蛋白逐渐被降解,形成成熟的心肌细胞,完成其生理性肥大生长过程。
【关键词】：大鼠 出生后发育 闰盘 跨膜蛋白 钙蛋白酶系统
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-27
• 第一部分 发育大鼠心肌细胞肌原纤维横向加入模型27-48
• 1 引言27-28
• 2 材料与方法28-31
• 3 结果31-42
• 4 讨论42-48
• 第二部分Calpain/calpastatin与闰盘蛋白装配48-71
• 1 引言48-49
• 2 材料与方法49-54
• 3 结果54-68
• 4 讨论68-71
• 小结71-73
• 参考文献73-80
• 个人简历和研究成果80-81
• 致谢81

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本文编号：568681