慢性炎症刺激对小鼠主动脉内皮脂肪酶表达影响的研究

发布时间：2017-08-06 00:05

  本文关键词：慢性炎症刺激对小鼠主动脉内皮脂肪酶表达影响的研究

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【摘要】：1研究背景和目的心脑血管疾病已成为威胁人类健康的头号杀手,动脉粥样硬化则是其重要的致病因素之一。目前认为,动脉粥样硬化发生和发展的主要原因是脂质代谢紊乱和炎症反应,虽然它们各自都是动脉粥样硬化独立的危险因素,但越来越多的研究表明,二者在动脉粥样硬化的发生发展过程中是相互影响和相互促进的。内皮脂肪酶是近年来新发现的甘油三酯脂酶家族的成员,在脂代谢过程中发挥着重要作用。内皮脂肪酶主要具有磷脂酶活性,是高密度脂蛋白代谢的关键酶,其主要由内皮细胞分泌产生,肝细胞和平滑肌细胞等也可有少量分泌。高密度脂蛋白是动脉粥样硬化发生发展过程中的保护性因素,因而抑制EL的活性或减少EL的表达,可能在一定程度上抑制动脉粥样硬化的发生发展。EL的表达调控受多种因素影响,炎症、血压及血管剪切力等都可影响EL的表达；此外,ANGPTL3是由肝脏分泌产生的一种细胞因子,在脂质代谢中发挥重要作用。相关研究表明其可能是内源性的EL抑制剂。由于炎症是动脉粥样硬化重要的致病因素之一。因此,进一步明确炎症调控内皮脂肪酶在体内表达的机制,则可能为我们在脂质代谢紊乱和炎症反应之间构建一个新的桥梁,进而为动脉粥样硬化的研究和干预提供新的思路。脂多糖(LPS)是重要的炎症反应的刺激物,它可以选择性的作用于细胞表面的Toll样受体4(TLR-4),从而激活细胞内的炎症反应信号通路,例如NF-κB信号转导通路等,研究已表明LPS可促进动物及人类的动脉粥样硬化的发生和发展。NF-κB信号转导通路和p38MAPK信号转导通路都是炎症反应时细胞内重要的信号传导系统。研究表明,其可能是各种危险因素导致动脉粥样硬化的机制之一。PDTC是一种金属离子螫合剂,其可以竞争性抑制IκBα的释放,进而抑制NF-κB信号传导通路的激活。SB203580可以选择性的抑制p38MAPK的激活,而对于JNK/SAPK和p44/42MAPK(即Erkl／2)无显著作用。本课题以野生型C57BL／6小鼠和ApoE-/-小鼠为研究对象,通过腹腔注射脂多糖作为慢性炎症刺激,观察在体内炎症环境下脂多糖对小鼠主动脉内皮脂肪酶(EL)、NF-κBp65、 p38MAPK及磷酸化的p38MAPK的表达影响,同时观察他汀类药物(阿托伐他汀钙)对该效应的抑制作用。此外通过腹腔注射NF-κB信号通路阻断剂PDTC和p38MAPK信号通路阻断剂SB203580进一步验证脂多糖是否通过NF-κ B和p38MAPK信号传导途径调节小鼠主动脉内EL的表达。2研究方法2.1动物模型的建立选取8周龄野生型雄性C57BL／6小鼠共40只,8周龄雄性ApoE-/-、鼠共8只,适应性普食喂养一周后,改为高脂饮食(15%黄油,0.25%胆固醇)喂养。实验分组共分为六组,每组8只,包括：①LPS(C57BL/6)组：腹腔注射LPS(2mg/kg),每周三次,持续12周；②LPS(ApoE-/-)组：同样给予腹腔注射LPS(2mg/kg),每周三次,持续12周；③阿托伐他汀钙组：腹腔注射LPS(2mg/kg),同时给予阿托伐他汀钙悬液灌胃(20mg/kg/d),持续12周：④正常对照组：腹腔注射生理盐水(2mg/kg),每周三次,持续12周；⑤PDTC组：腹腔注射LPS(2mg/kg),同时给予PDTC(20mg/kg/d)腹腔注射,持续12周；⑥SB203580组：腹腔注射LPS(2mg/kg),同时给予SB203580(5ug/kg/d)腹腔注射,持续12周。在药物干预的12周末,对各组小鼠进行安乐死。2.2血脂测定前4组(LPS(C57BL/6)组，，LPS(ApoE-/-)组,阿托伐他汀钙组,正常对照组)小鼠处死前,空腹经心脏采血,收集血清,检测甘油三酯(TG),总胆固醇(TC),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C).2.3血清[NF-a、IL-1β和ANGPTL3测定通过酶联免疫吸附实验(ELISA),用试剂盒对采集的前4组小鼠(同上)的血清进行TNF-a、IL-1β和ANGPTL3的含量测定。2.4 HE染色和免疫组化ApoE-/-组小鼠和正常对照组小鼠在药物干预12周后取材。取主动脉弓部至降主动脉长约1-1.5cm的组织,脱水后石蜡包埋,5um切片行HE染色。应用免疫组化方法检测ApoE-/-小鼠和正常对照组小鼠主动脉内EL的表达,Image-Pro Plus 5.0图像分析软件计算阳性面积占动脉粥样硬化斑块面积百分比。2.5Western Blot取前4组小鼠(同上)主动脉弓部至降主动脉长约1-1.5cm的组织,用加入了磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液裂解组织提取总蛋白,然后用BCA法测定蛋白浓度。电泳转膜,封闭,孵育一抗、二抗、发光,测量主动脉内EL.NF-κ B p65.p38MAPK以及p-p38MAPK的相对含量。2.6统计学分析实验数据采用均数±标准差(MEAN±SD)表示,两两比较采用非配对t检验,多个实验组之间的比较采用单因素方差分析(ANOVA).统计学分析采用Graph Prism5统计软件。P0.05,差异有统计学差异。3.结果3.1 LPS(C57BL/6)组和LPS(ApoE-/-)组小鼠血清中总胆固醇表达水平较正常对照组明显升高,p0.05； LPS(C57BL/6)组和LPS(ApoE-/-)组小鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)表达水平较正常对照组明显降低,p0.05。阿托伐他汀钙组小鼠血清总胆固醇表达水平较LPS(C57BL/6)组明显降低,而血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)表达水平,较LPS(C57BL/6)组小鼠明显增加,均p0.05。3.2 LPS(C57BL/6)组和LPS(ApoE-/-)组小鼠血清中TNF-α和IL-1 β表达量较正常对照组均明显增加,均p0.05。阿托伐他汀钙组小鼠血清TNF-α和IL-1β表达量则较LPS(C57BL/6)组小鼠明显降低,均p0.05。3.3 LPS(C57BL/6)组和LPS(ApoE-/-)组小鼠血清中ANGPTL3的表达量较正常对照组明显降低,均p0.05。阿托伐他汀钙组小鼠血清ANGPTL3表达量则较LPS(C57BL/6)组小鼠明显增加,p0.05。3.4 LPS(C57BL/6)组和LPS(ApoE-/-)组小鼠EL的表达量较正常对照组明显增加,均p0.05。阿托伐他汀钙组主动脉EL的表达量与单纯接受LPS刺激的C57BL/6小鼠相比明显减少,p0.05。3.5 LPS(C57BL/6)组小鼠和LPS(ApoE-/-)组小鼠主动脉内NF-κ B p65和p-p38MAPK蛋白表达量较正常对照组明显增加,均p0.05；阿托伐他汀钙组小鼠主动脉内p-p38MAPK蛋白表达量与单纯接受LPS刺激的C57BL/6小鼠相比明显减少,均p0.05,而NF-κ B p65蛋白表达量变化则不显著。3.6野生型C57BL/6小鼠在腹腔注射LPS的同时,腹腔注射PDTC,主动脉EL的表达量与单纯接受LPS刺激的C57BL／6小鼠相比明显减少,p0.05。3.7野生型C57BL/6、鼠在腹腔注射LPS的同时,腹腔注射SB203580,主动脉EL的表达量与单纯接受LPS刺激的C57BL/6、鼠相比明显减少,p0.05。3.8 HE染色结果显示正常对照组小鼠主动脉弓部内膜光滑,无明显增厚,内皮细胞排列整齐。ApoE-/-小鼠主动脉弓部内膜和中膜则有明显的动脉粥样硬化表现,可见多发的动脉粥样硬化斑块形成。免疫组化结果显示,正常对照组小鼠主动脉内几乎没有EL的表达,而ApoE-/-小鼠主动脉内膜,尤其是斑块内,则可见明显的EL的表达。4.结论1.LPS可以增加炎症因子TNF-α和IL-1β的表达,并可能通过这种慢性炎症反应促进野生型C57BL／6小鼠和ApoE-/-小鼠主动脉内皮脂肪酶的表达。2.LPS可能通过抑制ANGPTL3的表达促进小鼠主动脉内皮脂肪酶的表达。3.LPS促进小鼠主动脉内皮脂肪酶表达的效应可能部分通过激活NF-ΚB和p38MAPK信号传导途径实现。4.阿托伐他汀可能通过抑制p38MAPK信号通路的活性抑制LPS诱导的小鼠主动脉内皮脂肪酶表达增加的效应。5.内皮脂肪酶可能通过NF-κ B和p38MAPK信号通路促进ApoE-/-小鼠主动脉内动脉粥样硬化斑块的形成。
【关键词】：脂多糖 内皮脂肪酶 阿托伐他汀 NF-κB p38MAPK
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743;R543.5
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 符号说明16-17
• 前言17-21
• 实验材料21-25
• 实验方法25-33
• 结果33-37
• 讨论37-41
• 结论41-43
• 附表43-45
• 附图45-51
• 参考文献51-55
• 致谢55-56
• 攻读学位期间发表的学术论文目录56-57
• 学位论文评阅及答辩情况表57

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本文编号：627495