PD-1对小鼠体内免疫反应的调节在动脉粥样硬化形成中的作用

发布时间：2017-08-08 02:05

  本文关键词：PD-1对小鼠体内免疫反应的调节在动脉粥样硬化形成中的作用

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【摘要】：目的:目前,动脉粥样硬化在我国的患病率和发病率呈显著上升趋势,并已成为我国老年人的主要病死原因之一。最近的研究表明,炎症及免疫反应在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用。免疫细胞,特别是炎性细胞的浸润、激活及增殖在易损性动脉粥样硬化斑块的形成和进展中发挥着极为重要的作用。细胞程序性死亡受体1(PD-1)是近年来新发现的一种介导免疫抑制信号的共刺激分子受体,在激活的T细胞、B细胞和一些髓样细胞上表达。近年来,人们发现PD-1/PD-Ls路径与急慢性炎症、肿瘤、免疫耐受、自身免疫性疾病等密切相关。因为动脉粥样硬化的发生发展与免疫及炎症反应有着密切的联系,所以PD-1及其通路可能对动脉粥样硬化的发生发展发挥了重要调控作用。因此本研究旨在利用PD-1和Apo E双基因缺陷小鼠,来研究PD-1信号通路在动脉粥样硬化发展中的作用。方法:将PD-1-/-小鼠和Apo E-/-小鼠进行交配,获得PD-1-/-Apo E-/-双基因敲除小鼠。以同龄野生型PD-1+/+Apo E-/-小鼠作为对照组,分别测定6周时小鼠体重、血清三酰甘油、总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的基线水平。两组小鼠在高脂喂养12周后,再次检测其体重、血清三酰甘油、总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的水平。小鼠麻醉后,打开胸腔,用注射器穿刺左心室,用冷磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗左心腔和主动脉腔内的残余血液。自升主动脉处分离心脏与主动脉,并切除心脏下半部分,心脏上半部分用冷PBS冲洗残血后,包埋于OCT。钝性分离自主动脉弓至腹主动脉分叉处的主动脉节段,用冷PBS冲洗残血后,取标本进行分析。用油红染色法观察标本动脉粥样硬化情况。同时,利用免疫组化方法分析斑块内CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞数量或比例变化。利用流式细胞仪检测脾细胞总数、CD4+T细胞、CD8+T细胞及细胞表面CD26L、CD25的表达水平。利用细胞纯化柱纯化CD4+和CD8+T细胞用CFSE标记,从正常小鼠分离树突状细胞和巨噬细胞,经LDL处理后,按不同比例与CD4+和CD8+T细胞混合,经FACS检测确定CD4+和CD8+T细胞的增殖情况。将纯化后的CD4+和CD8+T细胞经抗CD3抗体激活,用酶联免疫吸附法检测上清中IL-2、IFN-γ、TNF-α的含量。同时,用酶联免疫吸附法检测高脂喂养12周后小鼠空腹血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平。结果:6周基线和高脂喂养12周末,实验组和对照组小鼠的体重、血清三酰甘油、总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平均无显著性差异;高脂喂养12周后,PD-1-/-Apo E-/-小鼠主动脉弓和降主动脉内膜内动脉粥样硬化斑块较对照组显著增多,管腔严重狭窄,主动脉根部切片显示动脉粥样硬化斑块面积是对照组的约2倍[(0.51±0.08)mm2 vs(0.29±0.06)mm2,P0.001]。免疫组织化学分析显示,12周高脂喂养后,实验组斑块内CD3+T淋巴细胞含量为(154.88±36.64)个/mm2,较对照组的(59.38±25.28)个/mm2显著增多,差异有统计学意义(t=2.14,P0.01)。进一步分析斑块内细胞的组成显示,PD-1-/-Apo E-/-实验组斑块内CD4+T淋巴细胞的数量是对照组的约3倍,CD8+T淋巴细胞也较对照组明显增加。巨噬细胞的数量在PD-1-/-Apo E-/-实验组斑块中也有增多,但平滑肌细胞的数量则在两组中无显著性差异。实验组脾脏中细胞总数、CD4+、CD8+T细胞的数量显著增多,其中CD3+CD62L-、CD3+CD25+细胞的表达也显著增高。而且,实验组T细胞经CD3抗体激活后分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α能力显著增强。当T细胞与巨噬细胞或树突状细胞共孵后,其增殖能力较对照组更强。12周高脂喂养后,实验组小鼠血清中TNF-α的水平较对照组显著增高,而IL-2、IFN-γ的浓度无显著差异。结论:本研究通过观察PD-1-/-ApoE-/-双基因敲除小鼠动脉粥样硬化的加速进展、斑块内细胞成分的变化以及T细胞功能的改变,提示了在激活的T细胞中PD-1/PD-Ls信号通路下调参与了动脉粥样硬化过程中T淋巴细胞的浸润,限制了动脉粥样硬化的形成。
【关键词】：PD-1 动脉粥样硬化 T细胞 粥样斑块 炎症
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 1 对象和方法15-22
• 1.1 实验对象和材料15-16
• 1.1.1 实验动物15
• 1.1.2 实验材料15
• 1.1.3 实验仪器15-16
• 1.2 研究方法16-21
• 1.2.1 动物模型的建立与鉴定16-17
• 1.2.2 动物的饲养及分组17
• 1.2.3 血脂水平检测17
• 1.2.4 实验标本收集17
• 1.2.5 动脉粥样硬化斑块面积的测量17-18
• 1.2.6 动脉粥样硬化斑块的免疫组化染色18
• 1.2.7 脾脏中淋巴细胞准备几流式细胞仪检测18-19
• 1.2.8 T淋巴细胞体外增殖实验19
• 1.2.9 T淋巴细胞内细胞因子检测19-20
• 1.2.10 血清中细胞因子的检测20-21
• 1.3 技术路线21-22
• 2 结果22-30
• 2.1 动物模型的鉴定22-23
• 2.2 体重和血清胆固醇水平23
• 2.3 动脉粥样硬化斑块的进展23-25
• 2.4 动脉粥样硬化斑块中的细胞形态学表现25-27
• 2.5 T淋巴细胞体内激活27
• 2.6 T淋巴细胞的增殖和分泌27-30
• 2.7 血清中细胞因子的变化30
• 3 讨论30-36
• 结论36-37
• 参考文献37-40
• 发表论文和参加科研情况说明40-41
• 综述 PD-1及其配体与动脉粥样硬化关系研究进展41-56
• 综述参考文献49-56
• 致谢56

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本文编号：637707