miR-21靶向调控Jagged-1在心肌纤维化中的作用

发布时间：2017-08-08 03:23

  本文关键词：miR-21靶向调控Jagged-1在心肌纤维化中的作用

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【摘要】：目的:基于Notch信号通路筛选出可能调控心肌纤维化的miRNA,从中选出调控作用最显著的miRNA(本研究筛选出miR-21/miRNA-21)。并进一步研究miR-21通过靶向调控Notch信号通路的配体蛋白Jag1(Jagged-1)在心肌纤维化中的作用。方法:1、分离大鼠心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblast,CFB),原代培养,传代培养至细胞最佳状态。实验分为三组:未加TGF-β1(Transforming growth factor-β1)组、10ng/ml TGF-β1组、10ng/ml TGF-β1+10μM DAPT组。经RNA抽提、反转录与q PCR,筛选调控心肌纤维化新型miRNA(假定为miRNA-X)。2、在TGF-β1刺激前,转染miRNA-X的抑制剂,通过WB(Western Blot)检测TGF-β1刺激下的Vimentin和α-SMA(α-smooth muscle actin)的表达情况,明确在TGF-β1刺激下,miRNA-X对心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化(Cardiac fibroblast-myofibroblast transformation,CMT)的影响作用。3、转染miRNA-X的抑制剂,阴性对照为无义的抑制剂,利用CCK8(cell counting kit)试剂盒检测miRNA-X对心肌成纤维细胞增殖能力的影响,进一步筛选出调控心肌纤维化效果最显著的miRNA。4、构建psi CHECK-2-Jag1 3’-UTR WT(Wild-Type)/Muta(Mutation),将pre-miR-21、对照质粒分别与psi CHECK-2-Jag1 3’-UTR WT、psi CHECK-2-Jag13’-UTR Muta共转染293T细胞,裂解细胞,检测荧光素酶的荧光强度,分析miR-21与Jag1的3’-UTR的相互关系。5、构建腺病毒Ad-GFP(Adenovirus-Green Fluorescent Protein)以及Ad-miR-21-sponge(Adenovirus-miR-21-sponge),分离大鼠心肌成纤维细胞,原代培养,传代至细胞生长稳定,分为两组,分别转染Ad-GFP以及Ad-miR-21-sponge,36h后以TGF-β1处理,提取蛋白,WB检测Vimentin、DDR2、a-SMA、Tensin的表达情况。利用CCK8试剂盒检测miR-21对心肌成纤维细胞增殖能力的影响,Transwell侵袭实验检测心肌成纤维细胞的迁移能力。WB检测Jag1蛋白表达。结果:TGF-β1刺激CFB细胞中,miR-21、miR-23b、miR-140表达量影响比较明显,其中miR-21可与Jag1的3’-UTR结合。阻断miR-21,可显著抑制心肌成纤维细胞的增殖能力,并可抑制其迁移能力,逆转TGF-β1刺激下心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。结论:miR-21通过靶向调控Notch信号通路的配体蛋白Jag1,抑制心肌成纤维细胞的增殖、迁移及心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,发挥抗心肌纤维化作用。
【关键词】：Notch信号 miR-21 Jagged-1 心肌纤维化
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文缩略词表9-10
• 第1章 引言10-13
• 第2章 材料与方法13-28
• 2.1 材料13-15
• 2.1.1 细胞及菌株13
• 2.1.2 腺病毒载体系统13
• 2.1.3 主要试剂13-14
• 2.1.4 主要仪器14-15
• 2.2 实验方法15-28
• 2.2.1 原代大鼠心肌成纤维细胞的分离15-16
• 2.2.2 RNA抽提、反转录与q PCR16-17
• 2.2.3 引物设计17-18
• 2.2.4 CCK8检测细胞活性18
• 2.2.5 病毒载体构建18-21
• 2.2.6 Luciferase验证实验21-22
• 2.2.7 Transwell侵袭实验22
• 2.2.8 Western Blot22-27
• 2.2.9 统计学分析27-28
• 第3章 结果28-34
• 3.1 筛选调控心肌纤维化新型miRNA28
• 3.2 差异miRNA对于CMT的影响28-29
• 3.3 差异miRNA对心肌成纤维细胞增殖能力的影响29-30
• 3.4 miR-21 靶点Jag1外源性Luciferase验证实验30-31
• 3.5 miR-21 对于Jag1表达量的影响31
• 3.6 miR-21 对于CMT的影响31-32
• 3.7 miR-21 对心肌成纤维细胞增殖能力的影响32-33
• 3.8 miR-21 对于CFB细胞迁移能力的影响33-34
• 第4章 讨论34-37
• 第5章 结论与展望37-38
• 5.1 结论37
• 5.2 展望37-38
• 致谢38-39
• 参考文献39-43
• 综述 miRNA与心肌纤维化的研究进展43-48
• 参考文献46-48

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本文编号：638049