Notch蛋白通过调节JAK-STAT通路促进心脏瓣膜间质细胞分泌BMP_S加速瓣膜钙化

发布时间：2017-08-15 09:38

  本文关键词：Notch蛋白通过调节JAK-STAT通路促进心脏瓣膜间质细胞分泌BMP_S加速瓣膜钙化

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【摘要】：研究背景随着社会老龄化加剧,以及检查手段的不断丰富,钙化性心脏瓣膜病的发病率显著增高,也越来越增加了人们的关注。实际上,钙化性瓣膜疾病早期并无明显临床表现,但随着疾病的发生发展会出现较为严重的并发症,甚至可以危及生命。到目前为止,仍然没有有效的药物及手段来干预钙化性瓣膜病的进展,主要原因就是对瓣膜钙化的发病机制并不十分明确。心脏瓣膜钙化的实质是瓣膜结缔组织结构发生纤维化及退行性变,使瓣膜变硬、增厚、变形及磷酸盐沉积,导致瓣膜的狭窄和(或)关闭不全,严重影响瓣膜的正常功能,甚至危及患者生命。现有研究表明瓣膜钙化可能与慢性感染及自身免疫有关,但仍然存在着很多争论,由于建立理想的体外瓣膜钙化研究模型比较困难,一定程度上也限制了对瓣膜钙化的发生机制的研究。心脏瓣膜由瓣膜内皮细胞(VECs)、瓣膜间质细胞(VICs)和细胞外基质,包括胶原蛋白,弹性蛋白和糖胺聚糖所组成。主动脉瓣膜分为三层结构:纤维层,松质层和室肌层。纤维层靠近流出道,由胶原蛋白组成,为瓣膜提供强度;室肌层靠近心室肌,富有弹性;松质层是中心层,主要由多糖构成的疏松结缔组织。瓣膜内皮细胞排列在与血液接触的瓣膜表面。瓣膜间质细胞则是形成瓣膜结构的骨架,参与瓣膜钙化全过程。手术切除下来的钙化瓣膜组织研究发现,瓣膜中有成骨样细胞的形成,BMP-2、BMP-4的表达明显增加。因此,目前认为成骨相关蛋白的积累,是瓣膜钙化导致功能障碍的主要发病机制之一。心脏瓣膜中起主要生理作用的是瓣膜间质细胞,瓣膜间质细胞表型改变也是促进瓣膜钙化的重要因素,抑制瓣膜间质细胞表型转变,维持瓣膜间质细胞处于静止表型可以明显的减少钙化。Notch蛋白为一种跨膜蛋白受体,人体有4种Notch受体(即Notch1-4)和5种Notch配体(Delta-like 1,3,4,Jagged1和Jagged2)。相关研究发现,Notch信号是T淋巴细胞发育所必须,参与人体免疫应答的多个环节。细菌脂多糖(LPS)可以诱导Notch蛋白与其相应配体结合,在γ-内分泌酶的作用下经过剪切形成其活性形式NICD,由胞内段释放入胞质,NICD在胞质内可以激活NF-κB、ERK、JAK-STAT等多条细胞炎症相关信号通路,促进细胞分泌IL-1、IL-6、IL-8、TNF-β等多种炎性因子,参与心脏瓣膜的炎症反应。同时,NICD可以通过RAM结构域和cdc/ankyrin重复序与CSL蛋白相结合,并募集核转录激活蛋白家族MAML,形成NICD-CSL-MAML转录激活复合体,从而激活HES、HERP、HEY等转录抑制因子家族的靶基因,募集组蛋白乙酰化转移酶,使组蛋白乙酰化抑制基因转录;另一方面,NICD可以激活瓣膜间质细胞Bcl-2蛋白表达,最终活化Caspase酶,从而引起瓣膜间质细胞的凋亡。JAK-STAT即一种非受体型酪氨酸蛋白激酶,JAK即Janus Kinase,STAT即Signal transducers and activators of transcription(信号传导及转录激活因子),现在已克隆成功4种JAK(JAK1-3和Tyk2)与6种STAT(Stat1-6)。配体诱发相应受体形成二聚体后发生自身酪氨酸磷酸化而激活,激活后STAT进入细胞核,与DNA模块上的特异蛋白结合,诱导目标m RNA的产生,最后转录、生成和释放各种目标产物[46]。JAK-STAT参与了体内炎症反应及细胞增殖的过程。我们推断JAK-STAT在瓣膜间质细胞的钙化中起一定的作用。本研究中我们采用β-甘油磷酸、抗坏血酸、地塞米松、重组型人BMP-2等因素干预,建立体外人心脏瓣膜间质细胞的钙化模型,假想钙化的瓣膜间质细胞表面Notch2表达高于正常瓣膜间质细胞,通过Notch2信号通路与JAK-STAT信号通路发生交互作用,促进瓣膜间质细胞分泌BMP-2/4,诱导瓣膜间质细胞表型转化,从而加速瓣膜的钙化进程。因此本研究为钙化性主动脉瓣疾病的发病机制及治疗提供了理论依据。本研究中我们首先建立人心脏瓣膜间质细胞的钙化模型,通过加强Notch2表达与抑制其表达,探讨对下游通路的调节作用,本研究共分为三部分进行。第一部分心脏瓣膜间质细胞体外钙化模型的建立目的通过体外培养人瓣膜间质细胞,采用β-甘油磷酸、抗坏血酸、地塞米松、重组型人BMP-2等因素干预,建立体外瓣膜间质细胞的钙化模型,探讨BMP-2与钙化瓣膜间质细胞之间的相关性,旨在寻找干预钙化的新靶点,为延缓瓣膜钙化进程提供了新的方向。方法取传4代的h VIC以1×105/ml的密度种植于两块6孔板内,分为两组,每组6孔,对照组中加入细胞培养液、10%胎牛血清以及60ng/ml重组型人BMP-2蛋白(2μl);实验组中加入培养液、10%胎牛血清以及60ng/ml重组型人BMP-2蛋白(2μl),100nmol/L地塞米松加入80μl,80μg/ml L-抗坏血酸加入120μl,6mmol/Lβ-甘油磷酸加入300μl,培养14天。Von Kossa染色体现细胞钙化情况,WesternBlot检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、白细胞介素-8(IL-8)、BMP-2/4蛋白表达,ELISA方法检测培养液上清BMP-2蛋白的表达。结果培养14天的实验组h VIC行Von Kossa染色,可见细胞可形成大小不等的结节,胞质内沉积物与细胞内结节被染成黑色,显示有钙质沉积;而对照组h VIC行Von Kossa染色,细胞形态结构较为清晰,胞质内及细胞周围仅有数个非特异性黑色颗粒。实验组可见有每孔钙化节结(57±7);对照组可见有每孔钙化节结(10±3),实验组的钙化节结多于对照组,两组比较有统计学意义(P0.03)。实验组h VIC中炎症因子(ICAM-1、IL-8)及钙化相关因子(BMP-2、BMP-4)的表达较对照组均升高。实验组h VIC培养液上清中BMP-2表达水平为(92.49±4.92pg/ml),明显高于对照组h VIC培养液上清中BMP-2表达水平(22.22±1.88pg/ml),差异有统计学意义(P0.02)。第二部分Notch蛋白的活化及心脏瓣膜间质细胞的炎性反应目的细菌脂多糖(LPS)可以诱导Notch蛋白与其相应配体结合,在γ-内分泌酶的作用下经过剪切形成其活性形式NICD,可以诱导瓣膜间质细胞炎性反应,使其发生表型转变,加速瓣膜钙化。通过对比钙化的瓣膜间质细胞与正常的瓣膜间质细胞Notch蛋白的表达,明确瓣膜炎性反应与瓣膜钙化之间的联系。方法取第一部分实验诱导钙化的h VIC以1×105/ml的密度种植于两块6孔板内,分为两组,每组6孔,对照组中加入细胞培养液;实验组中加入等量的细胞培养液外同时加入LPS 0.2μg/ml(即4μl/孔)刺激12小时以活化Notch蛋白。Western-Blot方法来检测Notch蛋白的活化,免疫荧光方法来检测Notch蛋白的表达,Von Kossa染色体现细胞钙化情况;取正常h VIC以1×105/ml的密度种植于6孔板内为对照组;取第一部分实验诱导钙化的h VIC为实验组,同时向两组h VIC内加入LPS 0.2μg/ml(即4μl/孔)刺激12小时以活化Notch蛋白。Western-Blot方法来检测BMP-2蛋白表达,ELISA方法检测培养液上清BMP-2蛋白的表达。结果实验组h VIC中Notch2、DLL4、NICD蛋白的表达较对照组均升高。免疫荧光结果显示实验组h VIC细胞表面Notch2蛋白的表达明显高于对照组。Von Kossa染色实验组可见有每孔钙化节结(45±3);对照组可见有每孔钙化节结(10±2),实验组的钙化节结多于对照组,两组比较有统计学意义(P0.04)。实验组h VIC中Notch2、BMP-2蛋白的表达较对照组均升高。实验组h VIC培养液上清中BMP-2表达水平为(69.74±2.32pg/ml),明显高于对照组h VIC培养液上清中BMP-2表达水平(31.02±1.68pg/ml),差异有统计学意义(P0.03)。第三部分Notch蛋白通过调节JAK-STAT通路促进心脏瓣膜间质细胞分泌BMPS加速瓣膜钙化目的Notch信号通路与JAK-STAT信号通路交互作用参与了瓣膜间质细胞向成骨样分化的过程,参与瓣膜间质细胞钙化。抑制Notch蛋白活化或抑制Notch信号下游通路激活,可以延缓瓣膜钙化的进程,为临床治疗瓣膜钙化性疾病提供新的靶点与依据。方法取第一部分实验诱导钙化的h VIC以1×105/ml的密度种植于两块6孔板内,分为两组,每组6孔,分别向两组h VIC内加入LPS 0.2μg/ml(即4μl/孔)刺激12小时以活化Notch蛋白,实验组h VIC内加入Notch蛋白特异性抑制剂DAPT50μmol/L(即4μl/孔),对照组h VIC不做处理,Western-Blot检测BMP-2/4蛋白表达及JAK-STAT磷酸化水平,ELISA法检测培养液上清中的BMP-2蛋白表达,Von Kossa染色体现细胞钙化情况;向两块6孔板内h VIC内加入LPS 0.2μg/ml(即4μl/孔),刺激1h、2h、4h、8h、12h后用Western-Blot分别检测JAK-STAT磷酸化水平;实验组h VIC内加入JAK-STAT磷酸化特异性抑制剂GLPG0634(10μg/ml);对照组中加入等量细胞培养液,Western-Blot检测BMP-2/4蛋白表达。结果实验组h VIC中BMP-2/4蛋白的表达较对照组均降低。实验组h VIC培养液上清中BMP-2表达水平为(28.94±2.28pg/ml),明显低于对照组h VIC培养液上清中BMP-2表达水平(79.44±2.93pg/ml),差异有统计学意义(P0.02)。Von Kossa染色实验组可见有每孔钙化节结(12±3);对照组可见有每孔钙化节结(30±2),实验组的钙化节结数明显少于对照组,两组比较有统计学意义(P0.05)。LPS刺激h VIC 1h、2h、4h、8h和12h,这5组不同的实验证实Notch2可以使JAK-STAT磷酸化并延迟其降解的时间,其中刺激4h(P0.05)和8h(P0.02)JAK-STAT磷酸化有统计学意义。结论(1)钙化的h VIC炎性因子ICAM-1、IL-8及BMP-2/4表达增多(2)TLR4激活可使Notch蛋白活化促进瓣膜的炎症反应(3)Notch蛋白高表达加强JAK-STAT的磷酸化从而促进h VIC分泌BMP-2/4加速心脏瓣膜的钙化进程
【关键词】：Notch 蛋白 人心脏瓣膜间质细胞 BMP-2 Notch 蛋白 人心脏瓣膜间质细胞 炎性因子 Toll 样受体 Notch 蛋白 JAK-STAT 人心脏瓣膜间质细胞 BMP
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.5
【目录】：

• 摘要7-13
• Abstract13-22
• 第一章 绪论22-28
• 1.1 Notch蛋白家族22-23
• 1.1.1 Notch 1-4 分子22
• 1.1.2 Notch蛋白在心血管疾病中的作用22-23
• 1.2 心脏瓣膜间质细胞23-24
• 1.2.1 心脏瓣膜间质细胞简介23-24
• 1.2.2 心脏瓣膜间质细胞的表型转化24
• 1.2.3 心脏瓣膜间质细胞在介导心脏瓣膜钙化中的重要作用24
• 1.3 本研究的目的、方法、意义及实验方案设计24-28
• 1.3.1 研究的目的24
• 1.3.2 研究的方法24-25
• 1.3.3 研究的意义25
• 1.3.4 研究方案的设计25-28
• 第二章 心脏瓣膜间质细胞体外钙化模型的建立28-39
• 引言28-29
• 材料与方法29-34
• 2.1 实验仪器和材料29-31
• 2.1.1 主要实验仪器29
• 2.1.2 主要实验溶液配制29-30
• 2.1.3 实验主要试剂和材料30-31
• 2.1.4 实验细胞31
• 2.2 实验方法31-34
• 2.2.1 心脏瓣膜间质细胞的体外培养31
• 2.2.2 心脏瓣膜间质细胞体外诱导钙化31-32
• 2.2.3 心脏瓣膜间质细胞Von Kossa染色32
• 2.2.4 Western-Blot检测ICAM-1,IL-8,BMP-2/4 表达32-34
• 2.2.5 ELISA方法检测培养液上清BMP-234
• 2.2.6 统计分析34
• 结果34-38
• 2.3 实验结果34-38
• 2.3.1 心脏瓣膜间质细胞的体外钙化模型的建立34-36
• 2.3.2 钙化的心脏瓣膜间质细胞炎症因子ICAM-1,IL-8 表达增多36
• 2.3.3 钙化的心脏瓣膜间质细胞BMP-2/4 表达增多36-38
• 讨论38-39
• 第三章 Notch蛋白的活化及心脏瓣膜间质细胞的炎性反应39-51
• 引言39-40
• 材料与方法40-46
• 3.1 实验仪器和材料40-42
• 3.1.1 主要实验仪器40
• 3.1.2 主要实验溶液配制40-41
• 3.1.3 实验主要试剂和材料41-42
• 3.1.4 实验细胞42
• 3.2 实验方法42-46
• 3.2.1 Notch蛋白的活化及心脏瓣膜间质细胞的炎性反应42-43
• 3.2.2 Western-Blot检测Notch蛋白的活化及对BMP-2 表达的影响43-44
• 3.2.3 ELISA方法检测培养液上清BMP-244-45
• 3.2.4 免疫荧光法检测Notch蛋白的表达45
• 3.2.5 心脏瓣膜间质细胞Von Kossa染色45
• 3.2.6 统计分析45-46
• 结果46-49
• 3.3 实验结果46-49
• 3.3.1 TLR4激活可使Notch蛋白活化促进瓣膜的炎症反应46-48
• 3.3.2 Notch蛋白的高表达可使钙化的心脏瓣膜间质细胞表达BMP-248-49
• 讨论49-51
• 第四章 Notch蛋白通过调节JAK-STAT通路促进心脏瓣膜间质细胞分泌BMPS加速瓣膜钙化51-64
• 引言51-52
• 材料与方法52-58
• 4.1 实验仪器和材料52-54
• 4.1.1 主要实验仪器52
• 4.1.2 主要实验溶液配制52-53
• 4.1.3 实验主要试剂和材料53-54
• 4.1.4 实验细胞54
• 4.2 实验方法54-58
• 4.2.1 Notch特异性抑制剂DAPT抑制Notch活化54-55
• 4.2.2 IL-8,LFA-3 等炎症因子加强心脏瓣膜间质细胞的炎症反应55
• 4.2.3 JAK-STAT通路特异性抑制剂GLPG0634抑制JAK-STAT通路的磷酸化55-56
• 4.2.4 Western-Blot检测Notch蛋白抑制，JAK-STAT通路抑制及对BMP-2/4 表达的影响56-57
• 4.2.5 ELISA方法检测培养液上清BMP-257
• 4.2.6 心脏瓣膜间质细胞Von Kossa染色57-58
• 4.2.7 统计分析58
• 结果58-63
• 4.3 实验结果58-63
• 4.3.1 Notch蛋白在介导瓣膜钙化中起到重要的作用58-60
• 4.3.2 Notch蛋白加强JAK-STAT的磷酸化从而促进瓣膜的钙化60-62
• 4.3.3 JAK-STAT的磷酸化可以调节BMP-2 和BMP-4 的表达62-63
• 讨论63-64
• 结论64-66
• 主要结论65
• 展望65-66
• 参考文献66-72
• 附录 1：主要英文缩略词索引72-73
• 附录 2：本人简历攻读硕士学位期间科研工作情况73-74
• 致谢74-75
• 文献综述 钙化性主动脉瓣疾病发病机制研究的新进展75-82
• 参考文献79-82

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