E1A激活基因阻遏子基因调控自噬溶酶体通路改善心肌缺血再灌注损伤的作用研究

发布时间：2017-09-04 20:32

  本文关键词：E1A激活基因阻遏子基因调控自噬溶酶体通路改善心肌缺血再灌注损伤的作用研究

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【摘要】：目的:E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是一个小分子量糖蛋白,前期的研究已经证实在心肌肥大和心肌纤维化中CREG过表达能够改善心功能,但CREG对心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion,MIR)损伤的作用未见报道。后续研究发现,CREG作为溶酶体相关蛋白,可能参与调控溶酶体的形成。因此,本文的目的是阐明CREG能否通过调控自噬溶酶体发生,改善MIR损伤。方法:(1)在南方动物模型研究中心购买CREG基因半敲除的小鼠模型即CREG杂合子(CREG+/-)小鼠,在本实验室继续饲养、繁殖。C57BL/6(CREG+/+)小鼠由沈阳军区总医院动物实验科提供。(2)通过CREG+/+小鼠皮下埋微渗透泵给予外源性重组CREG蛋白(re CREG)(0.3 mg/kg·day)建立CREG过表达组小鼠模型即re CREG+/+小鼠,通过给予溶酶体抑制剂Chloroquine(CQ,10 mg/kg·day)建立自噬损伤小鼠模型。(3)应用上述不同组小鼠模型通过结扎前降支缺血30 min,再灌注不同时间,建立小鼠MIR模型。(4)应用腺病毒载体和干扰RNA方法转染H9C2心肌细胞,建立CREG过表达和低表达的H9C2心肌细胞培养模型。(5)应用小动物超声仪于再灌注28 d检测各组小鼠的心功能,TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色检测心肌缺血情况。(6)应用RT-PCR方法检测CREG m RNA水平的表达。(7)应用蛋白印迹方法(western blot)和原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡的情况。(8)应用western blot和免疫荧光染色的方法检测自噬相关蛋白的表达。结果:通过western blot和RT-PCR方法研究发现,MIR后15 min开始,正常CREG+/+小鼠心肌中CREG蛋白的表达逐渐下降,2 h基本消失。CREG的m RNA水平无明显改变。在CREG+/-小鼠心肌中CREG蛋白表达下降更为明显(P0.05)。在re CREG蛋白治疗组中,re CREG+/+小鼠心肌中CREG蛋白未见显著下调。应用小动物超声仪检测小鼠MIR 28 d时的心功能发现:与CREG+/+小鼠相比较,CREG+/-小鼠的心功能损伤更为严重(P0.05),而re CREG+/+小鼠心功能改善比较明显(P0.05)。MIR 24h行TTC染色观察到CREG+/-小鼠的心肌坏死面积最大(P0.01),给予re CREG蛋白能够改善CREG+/+小鼠心肌受损现象,这些结果提示CREG能够改善MIR损伤时的心肌损伤,明显改善心功能。与CREG+/+小鼠相比较,MIR后CREG+/-小鼠心肌凋亡现象严重(P0.01),而re CREG+/+小鼠心肌细胞凋亡改善(P0.01);免疫荧光染色和western blot结果证实CREG+/-小鼠MIR早期自噬功能损伤严重,而给予re CREG蛋白时能够激活自噬通路。这些结果表明CREG参与凋亡和自噬的调控作用。为进一步证实CREG是否通过调控自噬通路对抗心肌细胞凋亡,我们在给予re CREG蛋白的同时给予溶酶体抑制剂CQ(10 mg/kg·day),TUNEL染色和western blot分析发现,抑制心肌自噬后,给予re CREG蛋白干预组心肌细胞凋亡较自噬未抑制组明显加重(P0.05)。小动物超声仪检测28 d的心功能发现:给予re CREG蛋白并同时给予CQ组小鼠的心功能较单独给予re CREG蛋白组明显恶化。这些研究提示,CREG可能通过调控自噬激活作用保护缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)引起的细胞凋亡,从而保护心功能。为深入探讨CREG调控自噬的分子机制,我们应用腺病毒和干扰RNA转染分别建立了CREG过表达(Ad CREG)和低表达(si CREG)的大鼠心肌细胞H9C2体外培养模型。分别给予早期自噬激动剂Resveratrol(Res,10μmol/L)和CQ(10μmol/L),然后饥饿处理细胞后,观察CREG对心肌细胞凋亡和自噬的调控作用。结果表明:Ad CREG组细胞凋亡较Ad GFP对照组减少,同时,心肌细胞自噬功能活跃;给予CQ后心肌自噬功能受到抑制,细胞凋亡明显加重(P0.01);与CREG正常表达的对照组相比,si CREG心肌细胞自噬发生障碍,细胞凋亡严重,应用Res后不能改善心肌细胞凋亡现象(P0.01),而对照组给予Res后心肌细胞凋亡减轻,自噬被激活。这些结果在细胞水平再次证实了CREG通过调控自噬对抗心肌细胞凋亡。进一步应用透射电镜观察到,给予饥饿刺激后Ad CREG细胞中自噬体和溶酶体形成增加(P0.01);而si CREG细胞中自噬体显著堆积,溶酶体形成显著减少(P0.01)。Lysotracker染色结果同样提示CREG过表达促进了细胞内溶酶体数量的增加,而CREG的缺乏使溶酶体的生成减少。并且,si CREG细胞中溶酶体膜蛋白LAMP1/LAMP2、溶酶体内蛋白水解酶cathepsin D/cathepsin L表达下降(P0.01),而Ad CREG细胞中这四种蛋白显著增多。这些发现说明了CREG可能参与了溶酶体的发生及功能,激活自噬通路。甘露糖-6-磷酸受体(Mannose 6-phosphate receptors,M6P/IGF2R)是重要的溶酶体酶转运受体,促进溶酶体的成熟发育。IGF2R也是CREG的受体,因此,我们假设在CREG参与溶酶体发生及成熟的过程中,IGF2R发挥重要的作用。研究发现,si CREG细胞中IGF2R蛋白的表达量较对照组和Ad CREG组明显增多;免疫荧光染色和免疫共沉淀检测到CREG的缺乏降低了IGF2R与LAMP2、cathepsin D的相互结合能力,减少了溶酶体酶的转运;而CREG过表达则提高了IGF2R与LAMP2、cathepsin D的结合能力。结果提示CREG与IGF2R相互作用,促进溶酶体的成熟。结论:CREG通过促进溶酶体发生及功能,激活自噬,对抗心肌细胞凋亡,保护MIR损伤引起的心功能障碍。
【关键词】：CREG MIR 损伤 心功能 凋亡 自噬
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 缩略语表6-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-21
• 1 自噬在心脏中的研究进展15-19
• 1.1 自噬的概述15
• 1.2 自噬在心脏调控中具有重要作用15-19
• 1.3 小结19
• 2 CREG概述及在心血管方面的最新研究进展19-21
• 2.1 CREG的简介19-20
• 2.2 CREG在心血管方面的研究进展20
• 2.3 小结20-21
• 实验一 MIR时CREG蛋白的表达变化及与凋亡、自噬的相关性研究21-30
• 1 材料21-24
• 1.1 实验动物21
• 1.2 主要仪器和设备21-22
• 1.3 主要试剂22-23
• 1.4 试剂配制23-24
• 2 方法24-26
• 2.1 建立小鼠MIR模型[93]24
• 2.2 IR后心肌的凋亡检测24-25
• 2.3 免疫荧光染色25
• 2.4 应用小动物超声检测心功能[94]25
• 2.5 TTC染色[95]25
• 2.6 统计学分析25-26
• 3 结果26-29
• 3.1 MIR后CREG蛋白表达下降26-27
• 3.2 CREG蛋白表达调控MIR引起的心功能损伤27
• 3.3 MIR后心肌凋亡情况27-28
• 3.4 MIR后心肌自噬的表达情况28-29
• 4 讨论29-30
• 实验二 MIR时CREG对凋亡和自噬的调控作用研究30-36
• 1 材料30-32
• 1.1 主要仪器和设备30-31
• 1.2 主要试剂31
• 1.3 试剂配制31-32
• 2 方法32
• 2.1 同时给予外源重组CREG蛋白和CQ32
• 2.2 TUNEL染色、免疫荧光染色、western blot方法同试验一32
• 2.3 统计学分析32
• 3 结果32-34
• 3.1 同时给予外源性重组CREG蛋白和CQ后，，缺血再灌注心肌组织中自噬蛋白的表达32-33
• 3.2 同时给予re CREG蛋白和CQ后，IR心肌组织中凋亡的检测33-34
• 3.3 抑制自噬后，检测MIR28 d的心功能34
• 4 讨论34-36
• 实验三 CREG调控自噬对抗凋亡的细胞学机制研究36-47
• 1 材料36-37
• 1.1 主要仪器和设备36
• 1.2 主要试剂36-37
• 1.3 试剂配制37
• 2 方法37-39
• 2.1 在H9C2心肌细胞系上建立CREG过表达模型[98]37-38
• 2.2 在H9C2心肌细胞系上建立CREG低表达的模型[98]38
• 2.3 处理不同的细胞模型[98]38
• 2.4 TUNEL染色38
• 2.5 Western blot检测方法38
• 2.6 免疫荧光染色38-39
• 2.7 免疫共沉淀（Immunoprecipitation, IP）39
• 2.8 统计学分析39
• 3 结果39-44
• 3.1 在H9C2心肌细胞上成功建立CREG低表达和过表达模型39-40
• 3.2 CREG低表达时凋亡和自噬的表达情况40-41
• 3.3 CREG高表达时凋亡和自噬的表达情况41-42
• 3.4 观察心肌细胞中自噬体和溶酶体的表达42-43
• 3.5 CREG与IGF2R的相互作用43-44
• 4 讨论44-47
• 小结47-48
• 参考文献48-58
• 个人简历和研究成果58-59
• 致谢59

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